實(shí)驗(yàn)三產(chǎn)果膠酶菌株的篩選

1、YUNNAN NORMAL U NIVERSITY本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào) 084120155姓名 張琰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)、班級 08生技班實(shí)驗(yàn)課程名稱發(fā)酵工程學(xué)實(shí)驗(yàn)教師及職稱 唐湘華（高級助理實(shí)驗(yàn)師）開課學(xué)期 2010 至 2011 學(xué)年 上 學(xué)期填報(bào)時(shí)間 一2010 年12月 一28 日云南師范大學(xué)教務(wù)處編印、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)序號(hào)-三實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)時(shí)間2010.12.13-12.23實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)果膠酶菌株的篩選基礎(chǔ)生物2 (121)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.1掌握菌種選育、菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化和微生物酶制劑酶活測定的基本方法;1.2 了解酶學(xué)性質(zhì)的研究。2.實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖 2.1實(shí)驗(yàn)

2、原理：2.1.1果膠酶概況2.1.1.1果膠質(zhì)：是高等植物細(xì)胞壁內(nèi)及細(xì)胞壁間的結(jié)構(gòu)性多糖，是一類高分子碳水化合物， 它的存在往往給果蔬加工等工藝帶來許多麻煩和損失。2.1.1.2果膠酶：是指能分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱，廣泛存在于高等植物和微生物中。2.1.1.3產(chǎn)生果膠酶的微生物：細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌，但目前商品果膠酶多數(shù)來自霉菌。2.1.1.4果膠酶的應(yīng)用：主要是用于果膠的分解，在水果加工、葡萄酒生產(chǎn)、麻類脫膠和飼料等方面 有著廣泛的應(yīng)用。2.1.2果膠酶的酶活測定方法2.1.2.1粘度降低法：利用粘度計(jì)測量在一定溫度、酶濃度和一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)果膠溶液的粘 度降低值。2.1.2.2脫

3、膠作用時(shí)間法：以脫膠作用的時(shí)間來測定果膠酶的酶活力。2.1.2.3次亞碘酸法：用滴定法定量測定半乳糖醛酸的生成量，以表示果膠酶的活力。2.1.2.4還原糖法(DNS法)：測定在一定溫度、酶濃度和一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，水解果膠產(chǎn)生的還原糖的量。測定原理：根據(jù)果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，后者是一種還原糖，與 3, 5 -二硝基 水楊酸共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物， 在一定的范圍內(nèi)，還原糖的量和反 應(yīng)液的顏色呈比例關(guān)系，可利用比色法在 540nm進(jìn)行測定。2.1.3微生物發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)品受以下條件制約：培養(yǎng)基成分：C源、N源、無機(jī)鹽、水和生長因子；培養(yǎng)條件：溫度、pH、溶解氧等；附加條件：誘導(dǎo)物、表面活

4、性劑等。2.1.4酶催化反應(yīng)的進(jìn)行受多種因素的影響：底物濃度；酶濃度；溫度；pH;激活劑；抑制劑。2.1.5酶活定義：在pH3.0、37 C條件下，每分鐘內(nèi)從底物溶液中分解釋放 1卩mol半乳糖醛 酸所需要的酶量為一個(gè)酶活單位 U/g。2.2實(shí)驗(yàn)流程：產(chǎn)果膠酶菌種的篩選果膠酶的分離純化培養(yǎng)測定篩選出的果膠酶的酶活3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料3.1 菌種篩選使用的培養(yǎng)基：3.1.1 基本培養(yǎng)基：果膠1.0%、磷酸氫二鈉0.5%、蛋白胨1.0%、瓊脂2.0%, pH4.53.1.2 分離培 ，養(yǎng)基：果膠0.5%、磷酸氫二鈉0.5%、瓊脂2.0%, pH4.53.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基果膠1.0%，磷酸氫二鈉0.

5、5%，蛋白胨1.0%, pH4.53.2 酶活測定使用的試劑：3.2.1 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液：稱取檸檬酸15.652g，檸檬酸鈉7.5g，溶解定容至1000ml，用0.1M NaOH或 0.1M HCl調(diào)節(jié)pH至3.0。（共配3000 ml，分裝6瓶）3.2.2 底物一一0.25%果膠溶液：稱取0.25g果膠，用上述緩沖液溶解，在電爐上加熱至完全溶解，用緩沖液定 容至100mL儲(chǔ)存于4C, 7天內(nèi)有效。 （共配200ml）3.2.3 DNS 試劑：稱取酒石酸鉀鈉182.0g，溶解于500 mL水中，加熱（不超過50C）,于熱溶 液中依次加入3-5二硝基水楊酸6.3g，氫氧化鈉21.0g，苯

6、酚5.0g，無水硫 酸鈉5.0g，攪拌均勻至溶解，冷卻后定容至 1000 mL,儲(chǔ)存于棕色瓶中，室溫 保存，7-10天后過濾使用。3.3 實(shí)驗(yàn)儀器：燒杯、三角瓶、試管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、試劑瓶、研缽等； 天平、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、電爐、恒溫水浴鍋、 記時(shí)器（精確到秒）、分光光度計(jì)等。4.實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)4.1 實(shí)驗(yàn)步驟：4.1.1 產(chǎn)果膠酶菌種的篩選: 困種米集：到賣水果處尋得一其上有菌體生長的桔子，備用，作為菌種采集來源。 基本培養(yǎng)基的配置配制基本培養(yǎng)基，并用火菌鍋火菌，備用。 倒平板（每組兩塊） 分離菌種在無菌操作臺(tái)內(nèi)操作，用接種環(huán)刮取桔子皮上的菌體，以“之”字型

7、在平板上 劃線，每組劃兩塊板。然后放置于恒溫箱中培養(yǎng)至菌體產(chǎn)生。 菌種純化配制分離培養(yǎng)基，高溫滅菌，倒平板（每組兩塊），備用；將分離平板上的菌 體接種在倒有分離培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行菌種分離。4.1.2 果膠酶的培養(yǎng)待分離純化的菌種長出后，配制發(fā)酵培養(yǎng)基（每組三瓶），高溫滅菌，備用； 取兩瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，從分離平板上挖取一塊小菌落丟至發(fā)酵三角瓶中，搖瓶發(fā) 酵培養(yǎng)；另從老師提供的斜面上挖取小塊菌種丟進(jìn)剩下的一個(gè)三角瓶中，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。4.1.3 測果膠酶酶活4.131繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線先配制一系列濃度不同的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用選定的顯色劑DNS進(jìn)行顯色，在540nm波長下分別測定它們的吸光度 A。以A為橫

8、坐標(biāo)，濃度c為縱坐 標(biāo)，則得到一條擬合度較好的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用完全相同的方法和步 驟測定被測溶液的吸光度，便可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的被測溶液濃度或含量。精確稱取0.100g半乳糖醛酸，用緩沖溶液定容至100ml,制得濃度為0.1mg/ml的半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支試管，編號(hào)，按照下表進(jìn)行操作:半乳糖醛酸溶液 體積（ml）0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛酸（mg0.00.20.40.60.8 :1.01.2緩沖液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS (ml)3333333定容總體積（ml）2020202020 :2020OD (540nn)4.

9、1.3.2 制備待測酶液取三瓶發(fā)酵液，分別離心，取上清液備用；將上清液解釋10倍制成稀釋酶液待測。4.1.3.3 測定酶活取酶液按照下表要求操作測定酶活:操作步驟空白管樣品管A樣品管B步驟1吸取1.8mL果膠底物 溶液吸取1.8mL果膠底物 溶液吸取1.8mL果膠底物 溶液步驟237C保溫5分鐘37C保溫5分鐘37C保溫5分鐘步驟3加入待測酶液0.2毫加入待測酶液0.2毫升升步驟437C精確保溫30min37E精確保溫30min37 T精確保溫30min步驟5加入3mLDN試劑終止反應(yīng)加入3mLDN試劑終止反應(yīng)加入3mLDN試劑終止反應(yīng)步驟6r混合均勻混合均勻混合均勻步驟7加入0.2毫升待測酶

10、 液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步驟8流水冷卻流水冷卻流水冷卻步驟9加蒸餾水10mL混勻加蒸餾水10mL混勻加蒸餾水10mL混勻步驟10OD4onm比色OD4onm比色OD4onm比色OD = (A+B / 24.134計(jì)算酶活根據(jù)酶活計(jì)算公式計(jì)算酶活4.2 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 在分離和純化菌種時(shí)，應(yīng)用力適度，切不可劃破培養(yǎng)基，否則，不利于菌種 的分離和純化； 純化菌種時(shí)，要挑取分離平板上較小的菌落進(jìn)行純化，大片的菌落雜菌較多， 同樣，發(fā)酵培養(yǎng)純化的產(chǎn)果膠酶菌種時(shí)也要挖取較小的單個(gè)菌落。 在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，每一濃度0D值要測兩次，最終取平均值，以減小誤差； 加入0.2ml

11、待測酶液時(shí)，應(yīng)小心不要滴在試管壁上，否則煮沸過后可能溶液 由于未有酶液還未開始反應(yīng)； 酶活測定時(shí)：試管上編號(hào)：貼上用圓珠筆寫上編號(hào)的膠布，以防止保溫或沸水加熱時(shí) 脫落；*移液槍的使用：向試管內(nèi)加入待測酶液或 DNS時(shí)，槍頭不要觸碰管壁， 也不要伸入液面下，連續(xù)吸取同一種溶液時(shí)可以不用更換槍頭！ 精確記時(shí)：每一管加入酶液的時(shí)間要記錄，每管之間間隔的時(shí)間要合理； 避免試管進(jìn)水：煮沸和用流水沖洗時(shí)； 分光光度計(jì)使用時(shí)：?提前半小時(shí)接通電源，打開機(jī)器開關(guān)使儀器通電，自檢；?將對照液及測定液分別裝入比色杯 3/4體積并用鏡頭紙擦干外壁，放入樣 品室；?調(diào)節(jié)測定所用波長540nm?以對照為參比；?測定的是

12、吸光值；?讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關(guān)閉開關(guān)，將比色杯沖洗干凈、浸泡于30%酒精中。 水浴鍋使用時(shí)：?水浴鍋的水量（蒸餾水）要超過試管中的液面；?各大組“處理時(shí)間”這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)共同在 1個(gè)水浴鍋中進(jìn)行。5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法5.1 Excel軟件的使用：繪制半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.2 酶活計(jì)算公式：酶活：E （U/g） = K X AX 5X NX 1000/ （TX W其中：A:樣品的OD值（平均值）K:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率N:稀釋倍數(shù)5: 0.2毫升反應(yīng)液轉(zhuǎn)換為1毫升體積T:反應(yīng)時(shí)間（min）1000:轉(zhuǎn)換因子 1mmol=100Qx molW:半乳糖醛酸的分子量（194g/mol）6.參考文獻(xiàn)【11

13、 .余龍江.發(fā)酵工程原理與技術(shù)應(yīng)用.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006【21 .陳守文.酶工程.北京：科學(xué)出版社，2008【31 .宋思揚(yáng)、樓士林.生物技術(shù)概論（第三版）.北京：科學(xué)出版社，2007【41 .袁勤生、趙健主編.酶與酶工程.華東理工大學(xué)出版社.2005【51 .袁勤生主編.現(xiàn)代酶學(xué)華東理工大學(xué)出版社.2001【61 .郭勇編.酶的生產(chǎn)與應(yīng)用（第一版）.化學(xué)工業(yè)出版社.2003【71 .教師實(shí)驗(yàn)課件、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果及其分析及其結(jié)論：1.1產(chǎn)果膠酶的菌種的分離純化：我們小組的分離平板上的菌種，長出來的較多，且菌落的分布較為合理，便于 挑取純化的菌落；而純化平板，雖然整個(gè)大組

14、，菌種長出來的不多，但是我們組的兩塊平板上均 長出了菌種，且其中一個(gè)平板上的菌種分離效果較好，單個(gè)小菌落很清晰。1.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：所測0D值如下表所示:半乳糖醛酸含量(mg0.00.20.40.60.81.01.20D平均值00.1280.3570.4600.6540.8250.935以半乳糖醛酸含量為丫軸，0D平均值為X軸，做標(biāo)準(zhǔn)曲線:半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.21.864.2O.210 0 0 0 0 <量含酸醛糖乳半4567y = 0.1606X - 0.1624R = 0.9942系列1 線性(系列1ODt標(biāo)準(zhǔn)曲線較為準(zhǔn)確，說明我們測量的較為準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有可用性。1.3果膠酶酶活

15、測定果膠酶測定0D值，并計(jì)算出平均值:分組0D值'-管A純化一純化二保臧困種空白000A0.1510.0160.020B0.152-0.0110.0210D平均值0.1520.0160.0201.4酶活的計(jì)算:根據(jù)0D平均值代入酶活計(jì)算公式，得酶活為：純化一：E=0.1606X 0.152 X 5X 10X 1000/ (30X 194)" 0.210IU純化二：E=0.1606X 0.016 X 5X 10X 1000/ (30X 194)" 0.022IU保藏菌種：E=0.1606X 0.020 X 5X 10X 1000/ (30X 194)" 0.

16、0275IU可以很直觀的看出來酶活較低。原因可能是分離和純化培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)過于 貧瘠，菌種在其上營養(yǎng)過于貧乏，產(chǎn)酶受到了抑制，導(dǎo)致酶活較低。2. 實(shí)驗(yàn)總結(jié)：2.1 實(shí)驗(yàn)成敗之處及其原因分析成功之處： 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的較好，每個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)基本在同一條直線上， 沒有需要丟棄 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，說明操作較為準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度高。說明我們在操作時(shí)，各 種試劑的取用量比較準(zhǔn)確，沒有太大誤差，實(shí)驗(yàn)操作也比較規(guī)范，盡大可能的減 少了實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差。 分離菌種時(shí)，得到了菌種，雖然純化后菌落很少，但是還是分離出來了。失敗之處 分離出來的菌種整體酶活較低，但是分離的第一組菌種是老師提供的產(chǎn)果 膠的菌種酶活的近10倍。

17、 我們的第二塊平板上的菌種 B管所測ODfi為負(fù)值，酶活為零，說明我們 操作時(shí)可能酶液滴在了試管壁上，未參加反應(yīng)，導(dǎo)致酶活無法測出。2.2 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及改進(jìn)措施 做好本實(shí)驗(yàn)需要把握的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：將培養(yǎng)基裝進(jìn)三角瓶、滅菌時(shí)的包扎、劃線分離接種、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、 分光光度計(jì)的正確使用、 若重做本實(shí)驗(yàn)，為實(shí)現(xiàn)預(yù)期效果，儀器操作和實(shí)驗(yàn)步驟的改善方法： 應(yīng)采用不同的菌種采集方式，比如還有土壤采集，因?yàn)橥寥朗俏⑸锏奶烊慌囵B(yǎng)基，其中有大量的微生物；并且采集地要與果膠的分解密切相關(guān)。 這樣才能 更容易分離出具有較高酶活的菌種。對實(shí)驗(yàn)的自我評價(jià)總的來說，我認(rèn)為我們小組本次的實(shí)驗(yàn)較為成功。首先，我們的分離平板上 長的菌種較好，并且純化平板上長出了不止一個(gè)小菌落；其次