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文檔簡介
1、蛋白質(zhì)提取常用試劑及操作方法一、原料選擇和前處理(一)原料的選擇早年為了研究的方便, 盡量尋找含某種蛋白質(zhì)豐富的器官從中提取蛋白質(zhì)。但至目前經(jīng)常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小,如下丘腦、松果體、細(xì)胞膜或內(nèi)膜等原材料,因而對提取要求更復(fù)雜一些。原料的選擇主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā墓I(yè)生產(chǎn)角度考慮, 注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。盡量要新鮮原料。但有時這幾方面不同時具備。含量豐富但來源困難,或含量來源均理想, 但分離純化操作繁瑣, 反而不如含量略低些易于獲得 純品者。一般要注意種屬的關(guān)系,如鯉的心肌細(xì)胞色素C較馬的易結(jié)晶,馬的血紅蛋白較牛的易結(jié)晶。要事前調(diào)查制備的難易情況。若利用蛋白質(zhì)
2、的活性,對原料的種屬應(yīng)幾乎無影 響。如利用胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)的活性,用豬或牛胰臟均可。 但若研究蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)時,原料的來源種屬必須一定。研究由于病態(tài)引起的特殊蛋白質(zhì)(本斯.瓊斯氏蛋白、貧血血紅蛋白)時,不但使用種屬一定的原料,而且要取自同一個體的原料。可能時盡量用 全年均可采到的原料。對動物生理狀態(tài)間的差異(如饑餓時脂肪和糖類相對減少),采收期及產(chǎn)地等因素也要注意。(二)前處理l. 細(xì)胞的破碎材料選定通常要進(jìn)行處理。要剔除結(jié)締組織及脂肪組織。如不能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn),則應(yīng)冷 凍保存。除了提取及胞細(xì)外成分,對細(xì)胞內(nèi)及多細(xì)胞生物組織中的蛋白質(zhì)的分離提取均須先 將細(xì)胞破碎,使其充分釋放到溶液中。
3、 不同生物體或同一生物體不同的組織,其細(xì)胞破壞難易不一,使用方法也不完全相同。如動物胰、肝、腦組織一般較柔軟,作普通勻漿器磨研即 可,肌肉及心組織較韌,需預(yù)先絞碎再制成勻槳。 機(jī)械方法主要通過機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。常用器械有:高速組織搗碎機(jī)(轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm,具高速轉(zhuǎn)動的鋒利的刀片),宜用于動物內(nèi)臟組織的破碎;玻璃勻漿器(用兩 個磨砂面相互摩擦,將細(xì)胞磨碎),適用于少量材料,也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等,兩面間 隔只有十分之幾毫米, 對細(xì)胞破碎程度較高速搗碎機(jī)高,機(jī)械切力對分子破壞較小。 小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取,也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。 但在磨細(xì)時局部往往
4、生熱導(dǎo)致變性或 pH顯著變化,尤其用玻璃粉和氧化鋁時。磨細(xì)劑的吸附也可導(dǎo)致?lián)p 失。 物理方法 主要通過各種物理因素的作用,使組織細(xì)胞破碎的方法。 I .反復(fù)凍融法于冷藏庫或干冰反復(fù)于零下1520 C使之凍固,然后緩慢地融解,如此反復(fù)操作,使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的變化,使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性,冰片將細(xì)胞膜破碎,使蛋白質(zhì)可溶化,成為粘稠的濃溶液,但脂蛋白凍結(jié)變性。 n.冷熱變替法 將材料投入沸水中,于 90 C左右維持?jǐn)?shù)分鐘,立即置于冰浴中使之迅速冷卻,絕大部分細(xì) 胞被破壞。m.超聲波法暴露于910千周聲波或10500千周超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動,只要有設(shè)備該法方便且 效果也好
5、,但一次處理量較小。 應(yīng)用超聲波處理時應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些 超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時宜慎重。IV.加壓破碎法加一定氣壓或水壓也可使細(xì)胞破碎?;瘜W(xué)及生物化學(xué)方法1. 有機(jī)溶媒法粉碎后的新鮮材料在 0C以下加入510倍量的丙酮,迅速攪拌均勻,可破碎細(xì)胞膜, 破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一般不變性,被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙酰洗, 經(jīng)濾紙干燥,如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。n.自溶法將待破碎的鮮材料在一定pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢米陨淼牡鞍酌笇⒓?xì)胞破壞,使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。比較穩(wěn)定,變性較難,蛋白質(zhì)不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取愈肽酶。自體融解時需要時間,需加少量甲
6、苯、氯仿等。應(yīng)防止細(xì)菌污染。于溫室30 C左右較早溶化。自體融解過程中PH顯著變化,隨時要調(diào)節(jié) pH。自溶溫度選在04C,因自溶時間較長,不易控制,所以制備活性蛋白質(zhì)時較少用。 m.酶法與前述的自體融法同理, 用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質(zhì)。但值得提出的是溶菌酶處理時,它能水解構(gòu)成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高,而多易結(jié)晶化。1g菌體加110mg溶菌酶,pH6.27.01h內(nèi)完全溶菌。于生理食鹽 水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌,雖失去細(xì)胞膜,但原形質(zhì)沒有脫出。除溶菌酶外,蝸牛酶及 纖維素酶也常被選為破壞細(xì)菌及植物細(xì)胞用。 表面活性劑處理:較常用的有十二烷基磺酸
7、鈉、氯化十二烷基毗淀及去氧膽酸鈉等。 此外一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞,可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì)胞脹破。2. 細(xì)胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分的材料,或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子,防止其他細(xì)胞組分的干擾,細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離,對于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。尤其近年來分子生物學(xué)、 分子遺傳學(xué)、遺傳工程等學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展,對分布在各種細(xì)胞器上的核酸和蛋白質(zhì)的研究工作日益 增多,分離各種細(xì)胞器上的各類核酸和特異性蛋白質(zhì)已成為生物大分子制備工作重要內(nèi)容之一。 各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的。DNA幾乎全部集中在細(xì)胞核內(nèi)
8、。RNA則大部分分布于細(xì)胞質(zhì)。各種酶在細(xì)胞內(nèi)分布也有一定位置。因此制備細(xì)胞器上的生物大分子時,預(yù)先須對整個細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)分布匹有所了解。以肝細(xì)胞為例整理如表1。表1蛋白質(zhì)、酶及核酸在肝細(xì)胞內(nèi)分布情況 細(xì)胞器名稱主要蛋白質(zhì)及酶類 核酸類 細(xì)胞核: 精蛋白、組蛋白、核酸合成酶系RNA占總量10%左右,DNA幾乎全部。粒線體:電子傳遞、氯化磷酸化、三愈酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、服合成等酶系 RNA占 總量5%左右,DNA微量。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(微粒體):蛋白質(zhì)合成酶系、羥化酶系RNA占總量50%左右。溶酶體:水解酶系(包括核酸酶、磷酸脂酶、組織蛋白酶及糖昔及糖昔酶等)。高爾基氏體:糖
9、昔轉(zhuǎn)移酶、粘多糖及類固醇合成酶系。細(xì)胞膜:載體與受體蛋白、特異抗蛋、ATP酶、環(huán)化腺昔酶、5'-核昔酸酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸酶等。 細(xì)胞液:嗜嚏和喋吟代謝、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白類RNA (主要為tRNA)占總量30%。二、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化方法很多,主要有:(一)根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱鹽溶;當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時,蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸鉉的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化
10、力,可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之失水”,于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液 pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程 度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有:(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清 蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。(2) pH值:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時在濃鹽溶液中的溶介度最低。(3)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時,欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地
11、一起沉淀出來(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質(zhì)含量在 2.5-3.0%。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸鉉、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最多的硫酸鉉,它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升;0度時飽和溶解度為 3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內(nèi),許多蛋白質(zhì)和酶 都可以鹽析出來;另外硫酸鉉分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質(zhì)變性。 硫酸鉉溶液的pH常在4.5-5.5之間,當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時,需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析, 即把蛋白質(zhì)溶液裝入
12、秀析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙),用緩沖液進(jìn)行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。2、等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小, 各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀, 但此法很少單獨(dú)使用, 可與鹽析法結(jié)合用。3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法用與水可混溶的有機(jī)溶劑,甲醇,乙醇或丙酮, 可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應(yīng)在低溫下進(jìn)行。(二)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半
13、透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾法是利用高壓力或離心力,強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之 一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged )和瓊脂糖凝膠(agarose gel )。(三)根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同,可將其分開。1、電泳法各種蛋白質(zhì)在同一 pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體
14、,電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度,當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時,到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。2、離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑(如:愈甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體"LANG="ZH-CN"纖維素),當(dāng)被分離的蛋白質(zhì) 溶液流經(jīng)離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上, 隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。(詳見層析技術(shù)章)(四)根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法 親和層
15、析法(aflinity chromatography )是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand )的分子能特異而非共價地結(jié)合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在,每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離( Separation ),提純(Purification ) 和鑒定(Characterization )是生物化學(xué)中的重要的一部分,至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的 方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出
16、來,因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。三、濃縮、干燥及保存(一)樣品的濃縮生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀,為了保存和鑒定的目的, 往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的:1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮通過降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低,減壓的真空度愈高,液體沸點(diǎn)降得愈低,蒸發(fā)愈快,此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。2、空氣流動蒸發(fā)濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發(fā) ,鋪成薄層的溶液,表面不斷通過空氣流;或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室,用電扇對準(zhǔn)吹風(fēng),使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā),而達(dá)到濃縮目的,此法濃縮速度慢,不適于大量溶液的濃縮。3、 冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰,鹽類及生物大分子不進(jìn)
17、入冰內(nèi)而留在液相中,操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然后緩慢地融解,利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時,不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面, 蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。4、 吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng),對生物大分子不吸附,易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇,聚乙稀毗咯酮、蔗糖和凝膠等,使用聚乙二醇吸收劑時,先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里,外 加聚乙二醇復(fù)蓋置于 4度下,袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水飽和后要更換新
18、的直至達(dá)到所需要的體積。5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的方 法,不液體在一定壓力下(氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^膜時,溶劑和小分子透過,大分子受阻 保留,這是近年來發(fā)展起來的新方法,最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽, 并具有成本低,操作方便,條件溫和,能較好地保持生物大分子的活性,回收率高等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇,不同類型和規(guī)格的膜,水的流速,分子量截止值(即大體上能被膜保留分子最小分子量值)等參數(shù)均不同,必須根據(jù)工作需要來選用。另外,超濾裝置形式,溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo超濾膜的分子量截留值:膜名
19、稱分子量截留值孔的大的平均直徑XM- 300300 , 000140XM- 200100, 00055XM- 5050, 00030PM-3030, 00022UM 2020, 00018PM- 1010, 00015UM 21 , 00012UM0550010用上面的超濾膜制成空心的纖維管,將很多根這樣的管攏成一束,管的兩端與低離子強(qiáng)度的緩沖液相連,使緩沖液不斷地在管中流動。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。 當(dāng)緩沖液流過纖維管時,則小分子很易透過膜而擴(kuò)散,大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法,由于透析面積增大,因而使透析時間縮短10倍。(二)干燥生物大分子制備得到產(chǎn)品,為防止變質(zhì),易于保
20、存,常需要干燥處理,最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫,易于氧化物質(zhì)的干燥和保存,整個裝置包 括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外,同時增加了溫度因素。在相同壓力下,水蒸汽壓隨溫度下降而下降,故在低溫低壓下,冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到 冰點(diǎn)以下使之變成固體,然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn),適用于各類生物大分子的干燥保存。(三)貯存生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。 干燥的制品一般比較穩(wěn)定,在低溫情況下 其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無明顯變化, 貯藏要求簡單,只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi) (內(nèi)
21、裝有干燥劑)密封,保持 0-4度冰箱即可,液態(tài)貯藏時應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。1、樣品不能太稀,必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏,樣品太稀易使生物大分子變性。2、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑,常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì) 和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸鉉糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。 此外,鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸 檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。3、 貯藏溫度要求低,大多數(shù)在0度左右冰箱保存,有的則要求更低,應(yīng)視不同物質(zhì)而定。細(xì)胞器的分離細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法。細(xì)胞經(jīng)過破碎后,在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)量
22、大小不同,沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域, 分離后即得所需組分。 細(xì)胞器的分離制備、介質(zhì)的選擇十分重要。最早使用的介質(zhì)是生理鹽水。因它容易使亞細(xì)胞顆粒發(fā)生聚集作用結(jié)成塊狀,沉淀分離效果不理想,現(xiàn)一般改用蔗糖、Ficoll (一種蔗糖多聚物)或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。水溶液提?。捍蟛糠值鞍踪|(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。 稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大,也是提取蛋白質(zhì)的最常用溶劑。 鹽溶液提?。?以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質(zhì)進(jìn)常注意下面幾個因素。1. 鹽濃度等滲鹽溶液尤以 0.020.05mol/L 磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L 氯
23、化鈉溶液應(yīng)用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用 0.1mol/L碳酸氫鈉液提取等。有時為了螯 合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質(zhì)的靜電結(jié)合,也常使用枸椽酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質(zhì)在低鹽濃度下濃度低,如脫氧核糖核蛋白質(zhì)需用1mol/L以上氯化鈉液提取??傊?,只要能溶解在水溶液中而與細(xì)胞顆粒結(jié)合不太緊密的蛋白質(zhì)和酶,細(xì)胞破碎后選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度及 PH, 一般是不難提取的。只有某些與細(xì)胞顆粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊 的,需采用有機(jī)溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。2. PH 值:蛋白質(zhì)提取液的PH值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi),即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。 如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè),酸性蛋
24、白質(zhì)選擇偏堿一側(cè),以增大蛋白質(zhì)的溶解度,提高提取效果。如細(xì)胞色素 C屬堿性蛋白質(zhì),常用稀酸提取,肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì),用稀堿提取。某些蛋白質(zhì)或酶與其分物質(zhì)結(jié)合常以離子鍵形式存在,選擇PH36范圍對于分離提取是有利的。3. 溫度:多數(shù)酶的提取溫度在 5C以下。少數(shù)對溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶,可適當(dāng)提高溫度,使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進(jìn)一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類,選擇 3750 C條件下提取,效果比低溫提取更好。此外提取酶時加入底物或輔酶,改變酶分子 表面電荷分布,也能促進(jìn)提取效果。4. 有機(jī)溶劑提?。河袡C(jī)溶劑提取用于提取蛋白質(zhì)的實(shí)例至今是不多的。但一些和脂結(jié)
25、合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì),不溶于水、稀鹽或稀堿液中,可用不同比例的有機(jī)溶劑提取。從一些 粒線體(Mitochondria)及微粒體(Microsome)等含多量脂質(zhì)物質(zhì)中提取蛋白質(zhì)時,采用 Morton的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少,親脂性強(qiáng),易透入細(xì)胞內(nèi)部,與 水也能溶解10% ,因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用,可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn),也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合,使蛋白質(zhì)在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣(pH310,溫度-2C至40 C)。丁醇法對提取堿性磷酸脂酶效果也是十分 顯著的。胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮
26、中。以60 70%的酸性乙醇提取效果最好,一方面可抑制蛋白質(zhì)水解酶對胰島素的破壞,同時也達(dá)到大量除去雜蛋白的目的。(1) 表面活性劑的利用:對于某些與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)和酶,也有采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等 處理。表面活性劑有陰離子型(如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等),陽離子型(如氧化節(jié)烷基二甲基鉉等)及非離子型( Triton X-100 、TirtonX-114、吐溫60及吐溫80)等。 非離子型表面活性劑比離子型溫和,不易引起酶失活,使用較多。對于膜結(jié)構(gòu)上的脂蛋白和結(jié)構(gòu),己廣泛采用膽酸鹽處理,兩者形成復(fù)合物,并帶上凈電荷,由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來研究膜蛋白使用表面
27、活性劑的稀溶液提取時,較喜歡用非離子型表面活性劑。(2) 對提取物的保護(hù):在各種細(xì)胞中普遍存在著蛋白水解酶,提取時要注意防止由它引起的水解。前面所講的降低提取溫度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多數(shù)蛋白水解酶的最適PH在35或更高些,因在較低 PH條件下可降低蛋白質(zhì)水解酶引起的破壞程度。低pH可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保留在酶原狀態(tài),不表現(xiàn)水解活力。加蛋白質(zhì)水解酶的抑制劑也同樣起保護(hù)作用,如以絲氨酸為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸,以疏基為中心的酶加對氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有機(jī)溶劑時也能產(chǎn)生相類似的作用。蛋白水解酶的性質(zhì)變化很大,上述條件均視具體對象而變化。 有一些蛋白含疏基
28、, 這些疏基可能是活性所必需。 在提 取這種蛋白不要帶入金屬離子和氧化劑。前者可往提取液中加金屬螯合劑如EDTA,后者可加入還原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質(zhì)帶一些非共價鍵結(jié)合的配基。 提取時要注意保護(hù),不 要使酸基丟失。(3)操作步驟 單層細(xì)胞的培養(yǎng),用室溫PBS洗細(xì)胞一次,然后甩干;懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,400g離心10min , 收集細(xì)胞棄上清液。 對于單層細(xì)胞培養(yǎng),將培養(yǎng)瓶置于冰上,每lOOmm培養(yǎng)瓶加入1 mL溶解緩沖液(4 C預(yù)冷);對于懸浮培養(yǎng),將盛細(xì)胞團(tuán)的試管置于冰上。按107個細(xì)胞加入1. 0ml裂解液(4 C預(yù)冷)。保存在冰箱的裂解液可隨時使用。 冰上放置3min ,不時敲擊貼壁細(xì)胞
29、培養(yǎng)瓶,或輕搖懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。 對于單層細(xì)胞培養(yǎng),敲擊培養(yǎng)瓶數(shù)次,混合均勻,在冰床上傾斜培養(yǎng)瓶使溶液集中于一側(cè),然后將裂解物移置另一支 1.5mL圓錐形試管。有些研究者喜歡從瓶壁刮取細(xì)胞,但除特殊要求外此舉并非必須。 單層培養(yǎng)的細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞均以10 000g , 413離心10min ,仔細(xì)吸取上清液盛于另一試管,不可攪動細(xì)胞團(tuán)。置冰上。此時,上清液可用于下一步的預(yù)處理。腦組織RIPA液提腦組織中的胞漿蛋白做western oRIPA母液(20ml配置示例)Tris 0.158g Nacl 0.18g ddH2O 10ml 濃 Hcl 調(diào) PH至 7.4(約加 100ul )加 40ul
30、 0.5M 高壓過的 EDTA定容至20ml , 4C保存。使用前加 1mg/ml 的 Aprotinin 100ul/100ml(-20 C 保存);1mg/ml 的 Leupeptin100ul/100ml(-20 C保存);200mmol/L PMSF 500ul/100ml(4C保存);200mmol/L 的Na3VO4 500ul/100ml(4C保存),200mmol/L 的 NaF 500ul/100ml(4 C保存)。因加完酶的RIPA液4C只能保存五天,所以母液可以多配置,臨用前再加酶。腦組織蛋白提取步驟:1. 在冰上使玻璃平皿預(yù)冷。2. 把腦組織放在預(yù)冷的玻璃平皿上,用剪刀
31、將腦組織剪碎。3. 用RIPA液懸浮腦組織。每 250mg腦組織加1ml的RIPA。4. 冰上勻漿腦組織,直至勻漿光滑(大致用30min ,多勻漿幾次,每次勻漿間隔1min以上)。5. 將勻漿轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 Eppendorf管中。6.4 C離心,8,2000 rpm 20min 留上清,棄沉淀。7. 轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中。8.4 C離心,18,000 rpm 45min 。9.保存上清。(含有胞漿蛋白和部分亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的膜蛋白)。脂肪組織蛋白質(zhì)的提取將脂肪組織樣品置于玻璃勻漿器中,按每毫克樣品2l裂解液的比例分別加入相應(yīng)體積的裂解液(9 mol/ L 尿素,4 %CHAPS ,65 mmol
32、/ L DTT),冰浴中用玻璃勻漿器上下勻漿共15次。將勻漿液置于 eppendorf管中,4 C、15 000 r/ min 離心1 h后吸取少量上清液,用Bradford法測定總蛋白質(zhì)濃度,其余上清液于-78 C凍存?zhèn)溆谩8闻K組織蛋白的提取1. 斷頭處死大鼠,(盡量讓血液流掉多些),取100-200毫克,冰生理鹽水洗 2次。2. 將肝臟用剪刀煎碎,倒入加入3倍體積的Lysis buffer緩沖液:10 mmol/L Hepes2NaOH (pH7. 8) 。 15mmol/L KCl , 1 mmol/L MgCl2 。 0. 1 mmol/L EDTA ,1 mmol/L DTT ,1 mmol/L PMSF , l g/ml Leupeptin3. 用玻璃勻漿器勻漿(冰上進(jìn)行)后,充分勻漿。4.12000rpm , 4度,離心 30分鐘取上清。腸黏膜組織蛋白的提取目的:WESTERN BLOT 檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟:1. 含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇:
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