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文檔簡介

1、三、流程及主要部件三、流程及主要部件流動相流動相選擇流動相選擇流動相前處理流動相前處理-過濾過濾流動相前處理流動相前處理-脫氣脫氣甲醇甲醇乙腈乙腈THF緩沖鹽緩沖鹽過濾:0.45 m或更小孔徑濾膜目的:除去溶劑中的微小顆粒,避免堵塞色譜柱,尤其是使用無機鹽配制的緩沖液脫氣:除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡高壓輸液泵及梯度洗脫裝置高壓輸液泵要求:1.泵體耐腐蝕 2.能在高壓下連續(xù)工作 3.輸出流量范圍寬 4.輸出流量穩(wěn)定,重復(fù)性好類型:1.恒流泵:輸出恒定體積流量流動相 注射泵(螺旋泵) 柱塞式往復(fù)泵 2.恒壓泵(氣動放大泵):輸出壓力恒定,系統(tǒng)阻力不變時流量恒定;系統(tǒng)阻力改變時流量不恒定。

2、高壓輸液泵可分為兩類:恒流泵和恒壓泵。恒壓泵: 主要指氣動放大泵,泵出口壓力在系統(tǒng)中是恒定的,流速由柱的阻力決定。恒流泵: 包括往復(fù)柱塞泵和螺旋柱塞泵,這類泵輸出的溶劑流量是恒定的,柱前的壓力由柱后的 阻力及系統(tǒng)氣密性決定。恒壓泵和恒流泵是指這兩種泵的工作原理,并不表明泵的操作方式。借助于電子控制電路,往復(fù)泵和柱塞泵也可以按恒壓方式操作。唯有氣動放大泵只能恒壓操作。三、高壓輸液泵三、高壓輸液泵1. 氣動放大泵氣動放大泵氣動放大泵是根據(jù)壓力傳遞原理而設(shè)計的。氣動泵有兩個界面,氣體推動的截面大,推動溶劑的截面小。由于截面兩端壓力相等,則輸出截面的壓強正比于兩個截面的比值。只要這種比值足夠大,則輸出

3、的溶劑可以獲得很高的壓力。氣動放大泵示意圖氣動放大泵示意圖2. 往復(fù)柱塞泵往復(fù)柱塞泵 目前作為商品出售的高壓恒流泵多為往復(fù)柱塞泵。在電機驅(qū)動下,柱塞桿在泵頭內(nèi)作作線性往復(fù)運動,完成將流動相吸入泵頭然后再輸出的過程。(1) 工作過程在吸液過程中,由于柱塞的運動而在泵腔內(nèi)形成負壓。此時由于色譜柱的存在,泵頭外的壓力顯然高于泵頭內(nèi),在這種情況壓差下,出口單向閥的寶石球落回到閥座上;而入口單向閥因為外界大氣壓大于泵腔內(nèi)的壓力,寶石球離開閥座,流動相順利地進入泵腔在輸液過程中,由于柱塞桿的運動使壓力增加,入口單向閥的寶石落回到閥座,入口單向閥處于關(guān)閉狀態(tài);當泵頭的壓力繼續(xù)增加,并且超過了泵頭外的色譜柱的

4、反壓時,出口單向閥開啟,流動相輸出。(2) 往復(fù)柱塞泵的特性往復(fù)柱塞泵每往復(fù)一次輸出的流量由柱塞的截面積和沖程決定。單位時間輸出的液體流量由單位時間內(nèi)柱塞往復(fù)的次數(shù)決定。往復(fù)泵可以連續(xù)不斷的以恒定的流量輸送液體,同時更換溶劑非常方便,特別適用于梯度洗脫的需要。往復(fù)泵的缺點在于柱塞是往復(fù)運動地,輸出流量和泵壓力有波動性。在系統(tǒng)壓力過高時有反吸現(xiàn)象。(3) 多頭往復(fù)泵 為降低液體輸送過程中所產(chǎn)生的脈動,最有效的方法是采用多頭往復(fù)泵,由專門設(shè)計的驅(qū)動裝置保證在任一瞬間都有液體輸出,以降低波動。雙柱塞往復(fù)串連泵雙柱塞往復(fù)串連泵(HP 1100)雙柱塞往復(fù)并聯(lián)泵雙柱塞往復(fù)并聯(lián)泵(HP1090)(4) 四

5、元泵(單元泵)(HP1100)四元泵(單元泵)屬于雙柱塞往復(fù)串連泵。四元泵啟動時,通過運行一個初始程序來決定第一個活塞能到達的最高位置。第一個活塞慢慢向上移動至最高位置,然后從那向回移動一個預(yù)定的路徑長度??刂破鲗⑦@個活塞位置存貯在記憶中。完成初始化后,泵開始設(shè)定參數(shù)的操作。主動閥打開,向下移動的活塞將溶劑吸入第一個泵頭,與此同時,第二個活塞向上移動,將溶劑送入系統(tǒng)。在完成一個由控制器決定的沖程長度后,驅(qū)動馬達停止,主動閥關(guān)閉。馬達反方向反轉(zhuǎn),移動第一個活塞向上至最高位置,同時移動第二個活塞向下。(5) 二元泵二元泵二元泵是指一個泵腔內(nèi)含有兩個相同的泵,它通過高壓混合產(chǎn)生梯度,二元泵不包括真空

6、脫氣裝置,但真空脫氣機可以作為單獨的產(chǎn)品定購,在需要最好的流動穩(wěn)定性時使用,特別是在低流速或最大檢測靈敏度時。二元泵中每個泵的工作原理與四元泵(單元泵相同)3.螺旋柱塞泵螺旋柱塞泵因其工作原理與注射器類似,也稱為注射泵。螺旋柱塞泵和往復(fù)泵的原理完全不同。電機以一定的轉(zhuǎn)速通過螺桿旋轉(zhuǎn)驅(qū)動柱塞上下移動。柱塞向下移動時,將液體吸入缸內(nèi),一次吸入數(shù)十毫升,可快速進行。柱塞向上移動時將液體排出。流量通過電機轉(zhuǎn)速控制。123 456 71溶劑出口溶劑出口 2三通閥三通閥3溶劑入口溶劑入口 4溶劑室溶劑室 5活動密封活動密封 6螺旋推動柱塞螺旋推動柱塞 7轉(zhuǎn)速驅(qū)動裝置轉(zhuǎn)速驅(qū)動裝置梯度洗脫裝置 梯度洗脫是使流

7、動相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑,在洗脫過程中連續(xù)或間斷改變流動相組成,以調(diào)節(jié)流動相極性。 梯度洗脫技術(shù)的優(yōu)點是:可提高柱效、縮短分析時間,也可改善檢測器的靈敏度。當樣品第一個組分的k和最后一個峰的k相差幾十倍至百倍時,采用梯度洗脫效果最好。此技術(shù)與氣相色譜法中的程序升溫相似。梯度洗脫方式有兩種:低壓洗脫和高壓洗脫l低壓梯度洗脫系統(tǒng): 常壓下將溶劑按程序混合,用一臺高壓泵送入色譜柱l高壓梯度洗脫系統(tǒng): 兩臺高壓泵將溶劑增壓后送入梯度混合室混合,再送入色譜柱 四、梯度洗脫裝置四、梯度洗脫裝置 根據(jù)溶劑混合的原理不同,梯度洗脫裝置可分成兩類:低壓梯度和高壓梯度 1.低壓梯度洗脫(泵前混合)低

8、壓梯度洗脫(泵前混合)低壓梯度:溶劑在常壓下混合,然后用一個高壓輸液泵把混合液輸送至系統(tǒng)中。方法簡單、經(jīng)濟,而且只需一個泵,所用溶劑元數(shù)沒有限制(一般最多為四元)。2. 高壓梯度(泵后混合)高壓梯度(泵后混合)高壓梯度:溶劑首先經(jīng)過高壓泵加壓,然后在混合室內(nèi)混合。高壓梯度一般使用兩臺高壓輸液泵,每臺輸送一種溶劑。進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)在液相色譜中,進樣方式有三種:柱頭進樣,六通閥進樣,自動進樣。三種進樣方式中,最理想的進樣方式是柱頭進樣,但由于實踐起來困難很大,因此在常規(guī)分析中主要采用六通閥進樣或自動進樣。一、六通閥進樣一、六通閥進樣 2.自動進樣器 自動進樣器是由計算機自動控制定量閥,按標準編制注

9、射樣品的操作程序工作。取樣、進樣、樣品管路清洗和樣品盤的轉(zhuǎn)動均按預(yù)定程序自動進行,一次可進行上百個樣品分析。2. 自動進樣器自動進樣器MainpassBypassLoadingInject and Run柱材料及規(guī)格1.柱材料:內(nèi)壁拋光的不銹鋼管2.柱規(guī)格:直型。內(nèi)徑4.6mm或3.9mm;長度1050cm柱溫控制 用柱溫箱控制柱溫。色譜柱色譜柱的測試與維護 商品柱都附有測試條件和報告。商品柱都附有測試條件和報告。色譜柱使用過程中的注意事項(1)儀器與柱子連接時,不要用力過大。(2)進樣前,樣品要處理。(3)更換流動相時,根據(jù)流動相性質(zhì)選擇合適的溶劑沖洗儀器和色譜柱,防止流動相不相溶或鹽析出,

10、堵塞柱子。(4)柱子存放過程應(yīng)密閉,防止固定相干燥,定期沖洗。色譜柱的選擇色譜柱的使用流動相:高純度、過濾、 pH范圍、 有機溶劑與色譜柱匹配 互溶、并能溶解樣品凈化樣品3. 使用保護柱:與色譜柱填料、內(nèi)徑一致避免色譜柱污染 擰三圈!退一圈!擰三圈!退一圈!檢測器檢測器 檢測器的作用是將從色譜柱中流出的物質(zhì)量的變化,轉(zhuǎn)變成可供觀測或檢測的信號,通常為電壓信號。該信號再通過記錄儀、積分儀或色譜工作站等進行色譜數(shù)據(jù)處理。 對于液相色譜而言,由于待分離樣品的所有組分均溶于流動相中而處于液相狀態(tài),樣品與樣品、樣品與流動相之間各種物理性質(zhì)接近,因此要尋找出一種即通用又靈敏的檢測方法比較困難,至今為止檢測

11、器的技術(shù)問題仍然是HPLC中的薄弱環(huán)節(jié)。HPLC中使用的檢測器種類1. 按檢測器用途分類按檢測器用途分類:檢測器可分為通用型檢測器(加和性質(zhì))和選擇性檢測器(溶質(zhì)性質(zhì))。通用型檢測器是利用連續(xù)測定色譜柱流出物質(zhì)某些具有普遍性的物理參數(shù)如折光指數(shù)、介電常數(shù)等而設(shè)計的檢測器。根據(jù)吸餾液(樣品與溶劑的混合物)與溶劑相同性質(zhì)的差別檢測被分析物質(zhì)。這種檢測器具有廣泛的適用性,但靈敏度低,容易受外界因素如溫度、流速、流動相組成等的影響,因此限制了使用范圍。選擇性檢測器是利用測定某些物質(zhì)特有的性質(zhì)如紫外吸收、熒光等而設(shè)計的檢測器,一般來說其靈敏度要比通用型檢測器的靈敏度高102103倍或者更高,并且受外界因

12、素包括流動相的組成變化影響極小或者沒有,但是在使用上僅限于測定對檢測器有相應(yīng)的物質(zhì)。檢測器檢測器2. 按檢測器測量性質(zhì)分類按檢測器測量性質(zhì)分類:檢測器可分為濃度型檢測器和質(zhì)量型檢測器。濃度型檢測器是連續(xù)測定樣品溶液的濃度變化,是反映總體性質(zhì)的檢測器,例如紫外、熒光 或示差檢測器就屬于此類。質(zhì)量型檢測器是測量樣品的總量,庫侖、同位素或質(zhì)譜檢測器就屬于這一類。檢測器檢測器3. 按測量原理分類按測量原理分類:檢測器可分為光學檢測器和電學檢測器。由于檢測器是影響色譜中的薄弱環(huán)節(jié),所以世界各國在研究開發(fā)方面投入了大量的精力和財力。從目前發(fā)表的文獻統(tǒng)計數(shù)據(jù)來看,光學檢測器(包括紫外、示差、熒光檢測器等)的

13、應(yīng)用占絕對多數(shù),隨著二極管陣列檢測器的推廣和應(yīng)用,這一比例還會增加。其次發(fā)展速度較快的是電學型檢測器(例如電化學、電導檢測器等)。另外各國也正在積極地開展HPLC與IR、MS、NMR等的聯(lián)用技術(shù)。檢測器檢測器HPLC檢測器的性能指標l噪聲與基線漂移l靈敏度l檢測限(定量限)l線性范圍l定性定量重現(xiàn)性l檢測器的池體積檢測器結(jié)構(gòu)(可變波長檢測器)檢測器結(jié)構(gòu)(可變波長檢測器)可變波長檢測器采用氘燈作光源,波長在190600nm范圍可調(diào)。光源發(fā)出的光經(jīng)過透鏡聚焦在入口狹縫上,光透過狹縫經(jīng)過反射到達光柵,光柵把190600范圍的光分成不同波長的單色光后,把某一波長的單色光經(jīng)過平面鏡反射至光分束器。透過分

14、束器的光經(jīng)過樣品池最終到達樣品光電二極管檢測器倍檢測;被光分束器反射的光到達參比檢測器被檢測。紫外檢測器的這種設(shè)計,使得它在某一時刻只能采集某一特定波長。為了對色譜過程中各個峰都獲得最靈敏的檢測,光柵可以編程控制,便于采集過程中變化波長。紫外檢測器適用范圍紫外檢測器適用范圍 紫外檢測器不是通用型檢測器,可以檢測有鍵及非共用電子對的物質(zhì),如烯烴,芳烴以及含CO,CS,NO,NN基團的化合物,這些化合物在紫外區(qū)都有吸收。 可變波長紫外檢測器可以認為是微量流通池來代替紫外/可見分光光度計的樣品池。l光源:D2燈/W燈l檢測波長:185400nm,或400600nm任選l靈敏、通用性更強l當前HPLC

15、儀配置最多的檢測器l不如單波長紫外檢測器穩(wěn)定l噪音水平也相對較大紫外檢測器不是通用型檢測器,可以檢測有鍵及非共用電子對的物質(zhì),如烯烴,芳烴以及含CO,CS,NO,NN基團的化合物,這些化合物在紫外區(qū)都有吸收。3 3. .光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 DADDAD與普通紫外檢測器的區(qū)別在于進入流與普通紫外檢測器的區(qū)別在于進入流通池的不是單色光,獲得的信號不是在某一波通池的不是單色光,獲得的信號不是在某一波長上的,而是在全部紫外光波長上的色譜信號。長上的,而是在全部紫外光波長上的色譜信號。因此,它不僅可進行定量檢測,還能提供組分因此,它不僅可進行定量檢測,還能提供組分的光譜定性信息。的

16、光譜定性信息。 光源經(jīng)聚光后,直接照射流通池,其透過光光源經(jīng)聚光后,直接照射流通池,其透過光經(jīng)光柵分光,分出的單色光,被光電二極管陣經(jīng)光柵分光,分出的單色光,被光電二極管陣列所接受,每一個二極管接受一個特定波長的列所接受,每一個二極管接受一個特定波長的信號。經(jīng)計算機處理,可獲得定量定性的色譜信號。經(jīng)計算機處理,可獲得定量定性的色譜光譜信息。光譜信息。DADDAD檢測器的特點:檢測器的特點:1.可以獲得多個波長的色譜圖,因此可以計算不同波長的吸收比。2.可在色譜分離期間,對每一個色譜峰的指定位置記錄吸收光譜圖。如果每一個色譜峰記錄三個位置的光譜圖(峰前沿、峰頂點、峰后沿),通過比較三個位置的光譜

17、圖,可判別色譜峰的純度及分離情況。3.在色譜運行期間可以進行逐點光譜掃描,得到的波長-吸光度三維圖形,由于每一個組分均有全波段的吸收光譜圖,因此可利用色譜保留值規(guī)律和光譜吸收曲線綜合進行定性分析。DAD檢測器結(jié)構(gòu)檢測器結(jié)構(gòu)熒光檢測器熒光檢測器(FD)l原理: 許多有機藥物,特別是芳香族藥物,被一定強度和波長的紫外光照射后,發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光。 F=Kc(低濃度)l特點: 1.噪音較大。 噪音水平:103mV 2.極其靈敏 。最小檢測限10-13g/ml 3.線性范圍很寬,可達106 4.適于梯度洗脫,受溫度影響小 5.可進行定量的濃度型檢測器 6.與UVD相比有非常高的靈敏度和良好的

18、選擇性,靈敏度、線性要比紫外檢測法高2-3個數(shù)量級,特別適合于藥物和生物化學樣品的分析。有紫外吸收的物質(zhì)可能有熒光。有紫外吸收的物質(zhì)可能有熒光。選擇最大激發(fā)和發(fā)射波長,提高靈敏度。選擇最大激發(fā)和發(fā)射波長,提高靈敏度。使用熒光衍生化試劑,測定沒有熒光的物質(zhì)。使用熒光衍生化試劑,測定沒有熒光的物質(zhì)。適合于生物樣品的測定。適合于生物樣品的測定。檢測器結(jié)構(gòu)檢測器結(jié)構(gòu)從氘燈或氙燈發(fā)出的激發(fā)光首先聚焦在第一個光柵,此光柵通過轉(zhuǎn)動選擇需要的激發(fā)波長聚焦在流動池。樣品經(jīng)過激發(fā)光的照射后發(fā)出熒光,熒光經(jīng)過聚焦和反射,到達第二個光柵,第二個光柵經(jīng)過轉(zhuǎn)動選擇檢測合適波長的熒光反射到檢測器檢測。使用熒光檢測器時,要注

19、意流動相組成對熒光發(fā)射的影響。溶劑自身的極性、pH值、氧的含量、溶劑的氫鍵作用等都會影響熒光的發(fā)射強度或發(fā)射波長。溶劑中的雜質(zhì),特別是氧的含量,可能完全抑制低熒光化合物發(fā)射的信號,因而溶劑需要脫氧。應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍熒光檢測器用于檢測能夠發(fā)射熒光的化合物,但本身具有熒光特性的有機或者無機化合物很少,可以通過衍生的方法使原來不發(fā)熒光的化合物發(fā)射熒光,進而對其進行檢測。下面表格列出某些固有發(fā)射熒光的物質(zhì)。化 合 物 種 類例 子芳香族和雜環(huán)化合物有機染料維生素和核甙酸類嘌呤和嘧啶類藥 物農(nóng) 藥卟啉類甾族化合物維他命二萘嵌苯和氮蒽若丹明6GFAD(黃素腺二核甙酸)和NAD(二磷酸吡啶核甙酸)腺嘌呤和胸

20、腺堿LSD(麥角酸二乙基酰胺麻醉劑)西 維 因膽紅素和原卟啉醋酸纖維素纖維和雌三醇B12(氰基鈷胺素)示差折光檢測器(DRD) 示差折光檢測器是通過連續(xù)監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折光率之差來測定樣品濃度的檢測器。由于每種物質(zhì)都有不同的折光率,因此示差折光檢測器屬于通用檢測器。特點:特點:l1.1.可進行定量分析的濃度型檢測器可進行定量分析的濃度型檢測器l2.2.噪音很小,噪音水平:噪音很小,噪音水平:1010-7-7mVmVl3.3.靈敏度很差,最小檢測限:靈敏度很差,最小檢測限:1010-6-61010-7-7g/mlg/mll4.4.線性范圍較窄,僅為線性范圍較窄,僅為10104 4l5.5.不適于梯度洗脫,受溫度、環(huán)境條件影響大不適于梯度洗脫,受溫度、環(huán)境條件影響大示差折光檢測器示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) 蒸發(fā)光散射檢測器是蒸發(fā)光散射檢測器是20世紀世紀90年代出現(xiàn)的最新型的年代出現(xiàn)的最新型的通用檢測器。理論上可用于揮發(fā)性低于流動相的任何通用檢測器。理論上可用于揮發(fā)性低于流動相的任何組分,但由于它對有紫外吸收的樣品組分的檢測靈敏組分,但由于它對有紫外吸收的樣品組分的檢測靈敏度較低,因而只要用于糖類、高分子化合物、高級脂

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