免疫分型基礎(chǔ)介紹

1、近年來白血病得免疫分型已成為診斷血液惡性月中瘤不可缺少得重要標(biāo)準(zhǔn)之一早年晉用過得熒光顯微鏡或 APAAP方法基本被廢棄。國際上公認(rèn)得通用得方法就是流式細(xì)胞術(shù)（FCM）。流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型就 是利用熒光素標(biāo)記得單克隆抗體（McAb）作分子探針,多參數(shù)分析白血病細(xì)胞得細(xì)胞膜與細(xì)胞漿或細(xì)胞核得 免疫表型由此了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。5、流式細(xì)胞儀診斷白血病得依據(jù)FCM能快速，多夢(mèng)數(shù)，客觀得走性又定重測(cè)走細(xì)胞膜、漿、核得抗原表應(yīng) 至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病得 特異抗原。a能用正箒血細(xì)胞得單抗來進(jìn)行免疫分型就是基于白血病形成得分化阻斷學(xué)說。即白血病細(xì) 胞基因異亀分化受阻于某階段形成不同亞

2、型得白血病、這群細(xì)胞充盈于骨譴。正箒血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分 化.發(fā)育.成熟為功能細(xì)胞得過程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或胞核抗原得出現(xiàn)、表達(dá)瑁多與減少甚至消失與血細(xì) 胞得分化發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)出與細(xì)胞系列及其分化程度相關(guān)得特異性。因此這些抗原得表達(dá)與否 可作為鑒與分類血細(xì)胞得基礎(chǔ)。白血病就是造血系統(tǒng)得惡性I中竊在形態(tài)上變化雖相當(dāng)尢但仍能表達(dá)正箒 血細(xì)胞所具有得抗嵐因而仍可依據(jù)其抗原得表達(dá)譜對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型。2、流式細(xì)胞儀診斷白血病得意義鼻骨龍血細(xì)胞就是形態(tài)學(xué)分型得基礎(chǔ),FCM白血病免疫分型就是對(duì) 形態(tài)學(xué)分型得重對(duì)卜充與進(jìn)一步深化'國際白血病MI C分型協(xié)作組認(rèn)為免疫分型對(duì)每一例急性白血

3、病都就 是必不可少得，對(duì)下列情況意義更大:用形態(tài)學(xué).細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來源得白血病.形態(tài)學(xué)為急 性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記.混合性白血病。 部分髓系白血病。目前，免疫分型對(duì)粒細(xì)胞與單核細(xì)胞白血病得鑒別尚有一左困難。慢性淋巴細(xì)胞白血 病.微小殘留白血病、臨床預(yù)測(cè);可根據(jù)抗原得表達(dá)情況預(yù)測(cè)病情得預(yù)后:如白血病患者有C D7+與C D 3 4 +共表達(dá),預(yù)后不好。 疾病監(jiān)測(cè):可監(jiān)測(cè)病程得發(fā)展療效可進(jìn)行微小殘留白血病得檢測(cè).二、免疫分型箒用得免疫標(biāo)志及其意義白血病系列分化抗原T淋巴細(xì)胞白血病:CD3、CD5、CD7。淋巴細(xì)胞白血病:CD

4、10. CD 19. CD2 2。NK淋巴細(xì)胞白血病:CD 16、CD56、CD57、龍系白血病:CD13、CD14、CD33、MPO（譴過氧化物酶）、鼻紅白血病:GlyA（血型糖蛋白A）. 巨核細(xì)胞白血病:CD41. CD4 2、CD 61。2、白血病系列非待異性抗原CD34、HLADR為早期細(xì)胞抗原，無系列特異性，可與CD38聯(lián)合運(yùn)用于免疫分型._般而言，干/祖細(xì)胞 CD34+、HLA DR+、CD38：原始細(xì)胞C D 34+、H L ADR+、CD38+,而幼嗣胞（如早幼粒細(xì) 胞）CD34、 HLACD38 +。3 白血病分化階段抗原T細(xì)胞抗原CD4、CD&丄B細(xì)胞抗原:CD10

5、、Cyp（胞漿唯）、Smlg（表面膜免疫球蛋白）.CD38與Cyl g（胞漿免疫球蛋白）、CD11G4 白細(xì)胞共同抗原CD4 5為白細(xì)胞共同坑原，其表達(dá)重在淋巴細(xì)胞最哥單核細(xì)胞,成熟粒細(xì)胞早期造血細(xì)胞（blasts）依次減弱。 紅細(xì)胞（中，晚幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞）不表達(dá)CD4 5。用SSC/ CD45 PerCP雙夢(mèng)數(shù)分析可十分容易鑒別 骨譴與血液中得原始或成熟細(xì)胞。用兩個(gè)系列或階段特異性McAb力Q CD45進(jìn)行三色免疫熒光染色經(jīng) FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2PE、CD4 5 PerCP五夢(mèng)數(shù)分析,可待異地分析原幼白血病細(xì) 胞得免疫表型而不受成熟細(xì)胞得干擾。三. 白血病及

6、淋巴瘤免疫分型5。AML魚M0:有低得SSC與FSC在CD 4 5SSC圖上出現(xiàn)在淋巴細(xì) 胞位置上至少表達(dá)一個(gè)特異性標(biāo)志如CD 13或CD 11 6,但MPO比CD13與C D 33更靈敏一般淋系標(biāo) 志陰性但也可表達(dá)CD7或CD4. -9QH LA- DR、CD34陽性有些研究表明CD7與CD34共表達(dá)在后差鼻M1:流式上Ml與M 0相（以不易區(qū)分,M1SSCD13 +、 CD33+、 HLA-DR-,旦C D34表達(dá)少于M0,可能表達(dá)部分CD15。M2: M0與M1得主要區(qū)別就是成範(fàn)度壻加,bl a sts減少fCD15較較顯吾CD34弱于M1.CD13 有時(shí)表達(dá)強(qiáng)于CD33,多數(shù)病例HLA

7、 - DR（）。CD4 5SSC圖顯示從譴系bla s t區(qū)至成熟骨髓細(xì)胞區(qū)得連 續(xù)細(xì)胞帝,CD45S SC圖有助于確定blasts比例。M 3、肓顆粒性,具較肓得S S C,但CD45較成範(fàn)C少，多數(shù)情況H L A -DR ()或表達(dá)減少,CD3 4少于M2、 -SQCD13弱(+),可有C D2表達(dá)。M4與M 5:兩型表型相似,但M4較M5表達(dá)更多得CD3 4 (+),較之M 0、M1,M4與M5有更大得FSS與 SSC,CD4 5SSC圖上超C出現(xiàn)在單核區(qū)，重要彳尋表型為CD 13、CD33、HLADR、CD14與 CD 1 5, CD 33可表達(dá)強(qiáng)于CD13fCD33(+k CD13(

8、-)X CD34()很可能為M 5,但只出現(xiàn)在少數(shù)病人 中郡分M5可見CD56(+)。M6: M6較少見且特征不明顯，一筱HLA-D&CD34. CD13、CD33陽性.CD45SSC圖顯示主要為紅 系成份-M7:巨核細(xì)胞白血病在AML中少于1%. 般CD61(GpHIa)與/或CD41(GpHb 陽性而注意由于血小板粘附在bl asts上造成得假陽性可以用流式雙色分析在EDTA存在下,測(cè)G p 口 b/nia與CD34以減少激;舌血4、板彳尋*占附.鼻2ALL:AL L就是兒堇中最箒見得惡性B中鶴約占全部腫瘤得25%,在成人AL L約占急性白血病得2 5 %，我們將 ALL分為B祖細(xì)

9、胞型,CD:L 0 +或CD10 前B細(xì)胞型,B細(xì)胞型.T細(xì)胞型。人B祖細(xì)胞型A L L 在幼兒約 占ALL得65% 7 0%清少年為55% 60%成人為5 0%、在兒蔓約90礙例CD10 + ,在幼兒只有 少于50%病例CD10 + .blast s F F S C、SSC很少，就是FAB標(biāo)準(zhǔn)得L 1或L乙一般T dT(+)H LAD R(+),CD19(+),此型又分為2個(gè)亞型,CD 10+與CD10 ，前者預(yù)后好,多數(shù)病例CD24+,CD34+,CD20 表達(dá)隨成熟度壇加而堵加B祖細(xì)胞被定義為sig-. 前B細(xì)胞型ALL此亞型約占兒童AL L得25%細(xì) 胞F為 CD19 + fCD24,

10、HLA DR +，胞漿 CD22 + fCD 10+. T dT 隨 CD 2 0 變化,CD34 多為陰性前 B 亞 型被認(rèn)為比B祖型預(yù)后更差這與t(1 ;19)出現(xiàn)相關(guān)齊由此產(chǎn)生E 2A-PBX1融合蛋白，它得表型為C D19+、 CD10 +、CD9 +，不同程度CD20表迖CD34：確認(rèn)此表型有助于診斷基因上不確走得病例-B細(xì)胞型 ALL:成熟B細(xì)胞型A LL約占ALL2% 5%,B細(xì)胞型AL L較之B迥細(xì)胞型A L L有更大得FSC與SSC在CD4 5SSC圉上出現(xiàn)在淋巴與單核細(xì)胞區(qū)域，即FAB標(biāo)準(zhǔn)得L3,表型為CD 19、CD20x CD 2 2. CD24 且s I g(多數(shù)為I

11、GM)多數(shù)病例C D1 0 +、但成熟抗原及sig使之區(qū)別于更早得B系A(chǔ) L L,極少數(shù)成熟B 細(xì)胞ALL無FAB-L3形態(tài).TALL:多數(shù)病例有大得F S C、SSC,在CD45 -SSC圖上可能出現(xiàn)在淋系未成卿胞與譴系未成熟細(xì)胞 或單核細(xì)胞區(qū)，多數(shù)表現(xiàn)為胸腺亞型,最箒見亞型為皮質(zhì)晚期表迖CD1、CD2、CD 5、CD7、CD4/ CD 8雙陽與極少膜表面CD3、TdT多為陽性。另一箒見亞型為皮質(zhì)早期表達(dá)CD2、CD 5、CD7、TdT強(qiáng) 表達(dá)。嚴(yán)期昭表達(dá)CD2、CD5、CD7、與CD3+CD4+/CD 3+ C D8+,很少見TdT表達(dá)、前T 細(xì)胞亞型表達(dá)C D7胞漿CD 3 +且無其它T

12、細(xì)胞抗嵐T細(xì)胞腫瘤得持征就是喪失T細(xì)胞抗原而表現(xiàn)出其 它異箒抗原組合、鼻雜合型白血?。弘S著流式技術(shù)得廣泛應(yīng)用,我們發(fā)現(xiàn)許多病例并不能嚴(yán)格劃分為淋系或龍系真正得雙表型病人多為t(9;22) 或(llq23),現(xiàn)在雜合型得誤診率很高最箒導(dǎo)致誤診得原因就是在分析中未能排除非白細(xì)胞，過度強(qiáng)調(diào)弱 得非待異性結(jié)合忽略了某些抗體缺乏系特異性，最重要得系特異性抗原在B系、T系、艙系分別為CD2 2、 CD3 與MPO。3a.CML:由于慢性期顯苦得細(xì)胞分化，在CD4 5 -SSC圖上除了譴系細(xì)胞占主導(dǎo)外,只顯示一個(gè)正常骨髓像,CML可確 診CML起病與發(fā)展相對(duì)緩慢,慢性期得持續(xù)1年左右最終發(fā)展為加速期與急變期

13、。流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)急變期 亞型得診斷具有極高價(jià)值.直接影響到治療效果.急變期CM L主要表現(xiàn)為騎系，偶為淋系髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變具典型形態(tài) 待征為CD1 0 + B祖細(xì)胞ALL極少有T細(xì)胞型ALL. 4-. C LLCLL細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大 得小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為:SIgM、SIgD弱表迖B系抗原為CD 19. CD20. CD43、CD79a與C D5共表達(dá),C D23表達(dá)使得CLL區(qū)別于帽細(xì)胞淋巴癌MU/BP(CLL:CD23+rM C L:CD2 3 -)#CD1 Q. CD2 3、C D11 c與CD2 5、CD2 0箒弱表達(dá)，盡管CLL起病慢

14、.但C L L病人得生存率變化很大，有染色體異 常得病預(yù)后不良最箒見得三聯(lián)體trisony12、14qJ3q、1 lq,免疫表型上沒有特異得變化而免疫表型得 變化并不就是提示染色體異常毘近，有研究表明，三聯(lián)體trisonyl 2與Sig、CD2 0表達(dá)重高度相關(guān)，與CD23 -相關(guān)與FMC 7相關(guān).鼻B型前淋巴細(xì)胞白血病(B-DLL)較CLL更為嚴(yán)重流式細(xì)胞技術(shù)在區(qū)分B-DL L 與CLL上發(fā)揮彳艮大作甩B-DLL多為CD 5CD22+,表達(dá)更強(qiáng)得sig。-MU病人平均生存率不超過5 年與C LL在形態(tài)上很難區(qū)分，與CL L相似有CD5+B祖細(xì)胞,但Sig表達(dá)強(qiáng)于CLJ且CD22.另一與CLL

15、難于區(qū)分得就是FCC,細(xì)胞為強(qiáng)Sig、CD5CD10 +、CD2 3+,具B系表型:對(duì)于診斷為 CLLXD5、FMC7、CD22與SIg,CD20異常強(qiáng)表表達(dá)得病例我們要考慮就是否為DLL、MCC或CLL 得亞型(t risomy12)因?yàn)樗鼈兾ｋU(xiǎn)性更大、人四、流式細(xì)胞儀免疫分型實(shí)驗(yàn)1。樣本采隼、運(yùn)輸、保存與操作樣本類型:適用于多種臨床標(biāo)本如外周血、骨髓穿刺液、骨譴活檢物、 淋巴樣組織活檢物、漿液、腦脊液、皮膚、黏膜(內(nèi)窺鏡活檢物)、細(xì)針穿剌物等等.亠抗凝劑得選擇:外周 血標(biāo)本可采用EDTAX ACD或肝素抗凝、如果用同一份血標(biāo)本做白細(xì)胞計(jì)數(shù)與流式分析,則應(yīng)用EDT A坑 凝.骨鬧刺可用肝養(yǎng)。

16、其她體液用EDTA、ACD或肝載均可，但保存得樣本活性可能會(huì)降低EDTA得優(yōu) 點(diǎn)就是成熟龍性細(xì)胞貼壁造成得損失及血小板聚隼較小/旦細(xì)胞散射光特征丟失較肝養(yǎng)標(biāo)本快;由于相對(duì)大 重得AC D會(huì)通過改變pH而影響骨譴細(xì)胞活性問逼通常不推存用A C D做骨髓芽刺坑凝劑、樣本彳孚保存:樣本得完整性與細(xì)胞活性與抗軽劑得選擇、運(yùn)輸、保存與溫度息息相關(guān)。 理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采隼后立刻進(jìn)行處理與染色。 短期保存(1小時(shí)或更短)應(yīng)在室溫(18 2 2°C); 長時(shí)間保存血或骨龍標(biāo)本室溫即可,有些樣本可能4°C為佳。 標(biāo)本保存得時(shí)間上限取決于標(biāo)本類型及其保存條件"肝養(yǎng)抗理得血與骨龍通

17、箒可保存至4872小時(shí)E DTA抗凝得血與骨髓可保存至12-24小時(shí)。丄AC D抗凝得血與骨髓可保存至7 2小時(shí)但對(duì)于只做胞內(nèi)染色得樣本，可固走細(xì)胞以長期保存。但？q uot;固定-染色“得方法取決于要分析得抗原特性 與染色方式采用之前一定要進(jìn)行新鮮標(biāo)本得對(duì)照與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、2樣本制備丄單細(xì)胞縣液得制備血與 骨髓:天然單細(xì)胞長液.當(dāng)有血凝塊時(shí)，應(yīng)用5 0um尼龍網(wǎng)過濾，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與血涂片以判斷靶細(xì)胞群體就是否仍然存在。組織塊:機(jī)械分離與酶分離兩種方法。分離不僅就是要獲得最大產(chǎn)重得單細(xì)胞長液，還要盡重保證細(xì)胞結(jié)構(gòu) 得完整性與抗原性、大多數(shù)淋巴樣組織可用輕柔得機(jī)械方法快速分廝并保持收獲細(xì)胞得相對(duì)

18、完整某些組 織由于細(xì)胞間連接緊密，需在機(jī)械分芮得基礎(chǔ)上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶.骨髓標(biāo)本亦可能因骨 細(xì)胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認(rèn)酶得使用沒有改變、減靶抗原得表達(dá)細(xì)胞活性沒有 顯苦降低。分離靶細(xì)胞群辰樣本得任何處理方式都可能導(dǎo)致靶細(xì)胞群體得丟失.所以應(yīng)盡可能使用最接近原始標(biāo) 本狀態(tài)得處理過程。去除紅細(xì)胞就是流式分析要求得至少步驟。兩種方法上紅細(xì)胞裂解:較佳.操作簡(jiǎn) 單、快.并最可能保持原始標(biāo)本得白細(xì)胞分布溶血?jiǎng)┑眠x擇應(yīng)基于其選擇性去除成範(fàn)紅細(xì)胞而最小程度 得彩響其她細(xì)胞得特點(diǎn)、最好在染色后溶血、若在染色前溶血'需確認(rèn):抗原性不被溶血過程改變；溶血?jiǎng)┍?徹底洗去，

19、細(xì)胞與抗體結(jié)合得動(dòng)力反應(yīng)未受彩響;所用溶血?jiǎng)┎缓套邉?，否則會(huì)影響細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié) 果。度梯度離心:白血病細(xì)胞回收較好并可能得到富隼，同時(shí)去除死細(xì)胞。但費(fèi)時(shí),白血病細(xì)胞得相對(duì)頻率較難 分析，某些重要細(xì)胞群體可能選擇性丟失、根據(jù)密度梯度原理若白血病細(xì)胞沒有與淋巴細(xì)胞相似得浮力密度 即可能丟失.所以用此方法時(shí)應(yīng)檢直各題胞特性以防止靶細(xì)胞得丟失.-估細(xì)胞長液 樣本夕卜觀有嚴(yán)重溶血與血凝塊得標(biāo)本可能會(huì)有白細(xì)胞得損壞以及細(xì)胞亞群得丟失或改變，應(yīng)棄用 細(xì)胞丟失與分布:確認(rèn)細(xì)胞形態(tài)與原始標(biāo)本相似。密度梯度離心之后更應(yīng)檢宜細(xì)胞分布。可做血涂片判斷。 亠細(xì)胞計(jì)數(shù)與濃度調(diào)整:廠家推存得抗體濃度通第就是假定靶細(xì)

20、胞數(shù)量在正帛范圍內(nèi)(5 0 0,0 0 0 1,0 00,000/testAbk白細(xì)胞數(shù)量上得顯著變化會(huì)芾來染色模式得變化。而白血病標(biāo)本第箒有異箒得白細(xì)胞 數(shù)量骨髓標(biāo)本也可能被外周血稀釋，這些標(biāo)本得細(xì)胞性可能有極大得變異。因此有些標(biāo)本沒有足夠得細(xì)胞做 流式分析,有些則由于細(xì)胞量尢正常濃度下得抗體相對(duì)不足不能飽與所有得結(jié)合位為導(dǎo)致假陽性結(jié)果所 以染色前得細(xì)胞計(jì)數(shù)非箒必要.推薦方法：WBC<1 000/u L:用200u L全血并調(diào)整招應(yīng)溶血?jiǎng)┯弥兀籛 BClOOO-10000/uU 用10OuL全血并用溶血?jiǎng)?biāo)準(zhǔn)重；WBCIOOOO-20000/uU用50uL全血并 調(diào)整相應(yīng)溶血?jiǎng)┯昧浚籛

21、BC >20000/u L,用稀釋至(2)(3)范圍內(nèi).骨髓標(biāo)本箒箒要在PBS 1:1 0稀釋 后計(jì)數(shù)應(yīng)該指也由于不同得標(biāo)本中不同系列得細(xì)胞比例不同，調(diào)整細(xì)胞總數(shù)不一定合適每一個(gè)系列持異得 抗體。實(shí)驗(yàn)室若選擇不同于廠冢推薦得方法(如目己稀釋抗體)，抗體一定需要進(jìn)行測(cè)試以得到坑體與細(xì)胞得 最佳比率。細(xì)胞活性:死細(xì)胞對(duì)許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時(shí)存在于胞腫與胞漿謔就使樣本得細(xì)胞活性檢 測(cè)變得重要尤其彩?鍬？ ？順肚奔溪腦聳浜痛4媯？軼匝?謨鬧譜輻?灘惶?完?葫<觀1姆椒uS辛街鄭閡 皇鞘凳*貝牧魘郊瞬豪?糜？饅玖損I、7 - AAD或EMA(eth ldium monoacid

22、e).活細(xì)胞將拒染這些 染料。此方法得優(yōu)勢(shì)就是細(xì)胞表面標(biāo)志與活性分忻可同時(shí)進(jìn)行,通過設(shè)門即可得到活細(xì)胞得染色特性。尤其 適用于高度壞死得樣本。樣本染色后需固定。應(yīng)在加固定劑之前洗去多余得7AAD,以保證區(qū)分得就是固定 前細(xì)胞得死活狀態(tài)。但隨肴時(shí)間延長f7AAD會(huì)在固定得細(xì)胞群體重新分配死活細(xì)胞得區(qū)分變難。對(duì)于染色 后箒規(guī)固定并在回定后12小時(shí)以上分析得標(biāo)本,最好用EM A。EMA與死細(xì)胞D NA穩(wěn)主得共價(jià)結(jié)合保證 了長時(shí)間固走后仍能好地區(qū)分固走前得死活狀態(tài)、二就是手工檢測(cè):使用Trypan b 1 ue或其她細(xì) 胞活性染料.細(xì)胞染色細(xì)胞表面染色:大多數(shù)可幫助白血病免疫分型得抗原都在細(xì)胞膜上、但

23、由于許多抗原也同時(shí)存在細(xì)胞內(nèi)， 所以在細(xì)胞表面抗原檢測(cè)時(shí)應(yīng)特別注意保持細(xì)胞膜得完整以保證檢測(cè)得特異性、例如免疫球蛋白重笹在細(xì) 胞內(nèi)與表面得存在有著不同得意義檢測(cè)表面標(biāo)記必須就是未回定得活細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)染色:有些胞內(nèi)特異 性抗原得檢測(cè)對(duì)白血病得免疫分型尤為重要如TdT, MPOf cCD3f cCD22,以及胞滎內(nèi)Ig得表達(dá)。胞 內(nèi)染色得關(guān)鍵就是使細(xì)胞膜通透,把抗體導(dǎo)入胞漿而不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)得完整性。要保證固定與透膜得步驟不 影響有關(guān)標(biāo)記得抗原性以及與抗體得結(jié)合。 胞膜與胞內(nèi)得同時(shí)染色:通常洗胞膜染色固走，腫通透與胞 內(nèi)染色，最后就是DNA染色、固主劑與通透劑都可能對(duì)細(xì)胞與參數(shù)有不同得多重影響應(yīng)根據(jù)

24、情況選擇、每 一步染色對(duì)熒光養(yǎng)得選擇與抗體得選擇冊(cè)艮重要.如用于表面標(biāo)記得熒光素應(yīng)不被隨后得固定與通透步驟 所彩響而對(duì)于胞內(nèi)染色，所用得熒光素應(yīng)足夠"'能穿透胞膜內(nèi)。3. 抗體組合得確主：選擇抗體組合得技術(shù)性考慮:基于血液腫瘤得復(fù)雜性，提供一個(gè)通用得抗體選擇策略就是不現(xiàn)實(shí)得。國際上迄 今也沒有_致性得抗體組合。應(yīng)該意識(shí)到，沒有_個(gè)神奇得既小又功能齊全得抗體組合可以解決所有得臨床 相關(guān)答宰。一個(gè)局限性得小組合也可能影響對(duì)樣本得正確評(píng)估與分類。確認(rèn)細(xì)胞異箒得能力與所用抗體得 數(shù)量直接成正比、»選擇抗體組合得基本原則如下工1)所選得抗體組合應(yīng)足夠気可以鑒別樣本中得所 有細(xì)

25、胞亞群包括正常與異常群體?？贵w得數(shù)量越多，檢測(cè)得靈敏度趣高。應(yīng)該指岀由于腫瘤細(xì)胞常常缺少細(xì) 胞得正常標(biāo)記或表達(dá)異常,所以待異性抗體一走程度上得重復(fù)選擇有時(shí)就是必要得。2)抗體得選擇應(yīng)可以 區(qū)分正箒與異常細(xì)胞正箒細(xì)胞可作為實(shí)驗(yàn)得內(nèi)參照，異常細(xì)胞得表達(dá)比例也更準(zhǔn)確。如現(xiàn)在用CD4 5抗體 來區(qū)分正常與幼稚細(xì)胞，此方法尤其在幼稚細(xì)胞含重少時(shí)更顯優(yōu)勢(shì)。-3)熒光強(qiáng)度與表位密度應(yīng)同時(shí)考慮。 對(duì)表達(dá)少得抗原表位應(yīng)盡可能選擇強(qiáng)度強(qiáng)得熒光養(yǎng)。4)必要時(shí)用活性檢測(cè)排除死細(xì)胞較強(qiáng)得非特異性染 色.國夕卜統(tǒng)計(jì)，約70%組織樣本與4 8%血或骨龍標(biāo)本有活性檢測(cè)結(jié)果.5町實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)了解所用抗體得反 應(yīng)細(xì)胞譜，以及與特定

26、熒光素結(jié)合后得染色模式。相同得CD編號(hào)得不同抗休可能有不同得結(jié)合模式。a 常用得方宰考慮:大而全得抗體組合:全面了解抗原表迖無需額外染色，省時(shí)但費(fèi)用高。先用篩直試劑了解樣 本得一股情況，再根據(jù)所得信息采用第二線特異性更肓得抗體組。經(jīng)濟(jì),但費(fèi)時(shí)也需要正確得抗體選擇得策 略性決定。但考慮到所用時(shí)間與設(shè)備費(fèi)用,只有約30%國外實(shí)驗(yàn)室采用此法?；谂R床或形態(tài)學(xué)得資料, 選用有目標(biāo)性得抗體組合以確認(rèn)可疑得診斷或分類。4、樣本獲取鼻通鳥每個(gè)標(biāo)本應(yīng)獲取1-2x104個(gè)有核細(xì)胞得熒光與散射光信號(hào)，微小殘余病變分析則需5 X104個(gè)細(xì)胞。惡性細(xì)胞箒有較竟得大小與粒度范圍獲取時(shí)最好收隼無門得數(shù)據(jù)以保留所有未知異箒

27、細(xì)胞 群體得所有特性.免疫熒光信號(hào)要求對(duì)數(shù)放大與至少256道得分辨率。無論選擇對(duì)數(shù)或線性放大都要以保 證異箒細(xì)胞都能被檢測(cè)到.5、數(shù)據(jù)分析鼻只有通過多參數(shù)分忻，才能最大程度地區(qū)分異質(zhì)得樣本中得正 箒與異箒細(xì)胞、多參數(shù)分析意味著綜合細(xì)胞得光散與多色熒光特征、最少得要求應(yīng)就是4個(gè)參數(shù)（2個(gè)光 散射與2個(gè)熒光參數(shù)）。采用得參數(shù)越多，分析步驟越復(fù)雜，流式免疫分型得靈敏度趣高。 分析技術(shù):數(shù)據(jù) 得分析方式隨樣本得特性、抗體組合及臨床痔況得不同而變化.但總得原則就是要用多參數(shù)得數(shù)據(jù)創(chuàng)造可 以區(qū)分正常與異箒細(xì)胞得圖形如F SC vs、SSC,FL vs、FL, Sc a tt e r vs. F L等，散光

28、與熒光參 數(shù)得綜合分析箒箒能提供有效得信息。分析步驟:首先分析所有細(xì)胞得抗原表達(dá)情況，鑒別出正箒細(xì)胞與異常細(xì)胞群體，正箒細(xì)胞得表現(xiàn)可以作 為整個(gè)實(shí)驗(yàn)染色過程得內(nèi)部參照,提供實(shí)驗(yàn)一致性與否得客觀證據(jù)，異箒細(xì)胞則通過進(jìn)一步設(shè)門分析確定表 型特點(diǎn). 設(shè)門:即選擇待殊得細(xì)胞群體分析其各個(gè)參數(shù)得表現(xiàn)，就是一個(gè)基本得分析技巧。把分析局限在門內(nèi)得細(xì) 胞群體得前提就是門內(nèi)得細(xì)胞代表所有感興趣得細(xì)胞而且沒有其她細(xì)胞得污染。一般來說，不同疾病得設(shè)門 策略亦不同癢用得FSC vs、SSC得設(shè)門方式可能不總就是適用于L&L分析，如在急性白血病中,CD45 與S SC得雙夢(mèng)數(shù)顯示就是鑒8呦稚細(xì)胞得一個(gè)簡(jiǎn)單而有效得方法;在B細(xì)胞淋巴瘤中用一個(gè)全B細(xì)胞得抗 體設(shè)門來瞧抗邂與抗A璉得表現(xiàn);T細(xì)胞淋巴瘤時(shí)用一個(gè)全T細(xì)胞抗體設(shè)門使腫瘤細(xì)胞得分型更加明確。另 外，通過細(xì)胞特異得抗原表達(dá)確定其光散射區(qū)域得”b a c k