試驗(yàn)10大腸桿菌非中斷雜交試驗(yàn)

1、遺傳實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)10大腸桿菌非中斷雜交實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解細(xì)菌有性雜交的原理，學(xué)習(xí)合作實(shí)驗(yàn)，熟悉點(diǎn)菌。2. 掌握利用非中斷雜交法進(jìn)行基因定位的原理，并利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。二、實(shí)驗(yàn)原理F+菌株：帶有F因子的菌株F-菌株：不帶F因子的菌株Hfr品系：F因子整合入細(xì)菌染色體F'菌株：由Hfr菌株染色體中F因子的不正常環(huán)出造成 F'因子含有供體細(xì)胞的特定基因其中，帶有F因子的菌株能夠與不帶 F因子的菌株（F-菌株）進(jìn)行雜交進(jìn)而發(fā)生基因重 組。F因子一般游離于細(xì)菌染色體之外，也可能整合到染色體上，因此是一種被稱為附加染 色體的質(zhì)粒。帶有F因子的細(xì)菌，細(xì)胞表面會(huì)形成一種與細(xì)胞接合作用相

2、關(guān)的毛狀突起，被稱為性纖毛，長(zhǎng)約1-20111。性纖毛促使供體和受體細(xì)胞特異地配對(duì)，在受體細(xì)胞上有纖毛的特異結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)性纖毛結(jié)合到這些特異性位點(diǎn)之后，開始收縮并將2個(gè)細(xì)菌拉攏形成作為遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移通道的接合管，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移就開始了。F+菌株和F-菌株雜交發(fā)生基因重組的頻率約為10-7; Hfr品系，其和F-菌株雜交時(shí)發(fā)生重組的頻率為10-4;通過(guò)F'因子介導(dǎo)的供體菌向受體菌特定基因的轉(zhuǎn)移被稱為性導(dǎo)。在雜交過(guò)程中，接合細(xì)菌可以在2小時(shí)中緩慢地進(jìn)行遺傳物質(zhì)的傳遞，在雜交不同時(shí)間進(jìn)行強(qiáng)力攪拌，打斷接合細(xì)菌之間的接合管，從而終止遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。所以對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)移起點(diǎn)越近的基因進(jìn)入受體菌的幾率越大

3、，因此可以通過(guò)繪制基因的轉(zhuǎn)移曲線推斷出基因順序并以時(shí)間為單位進(jìn)行染色體作圖，這種方法就是中斷雜交作圖。本實(shí)驗(yàn)采用的是非中斷雜交，不同的高頻重組品系（ Hfr）中F因子與主染色體的整合 位置是不同的。Hfr菌株與F-菌株進(jìn)行結(jié)合，染色體由Hfr向F-轉(zhuǎn)移，由于染色體的轉(zhuǎn)移是單方向性的，染色體上的基因都是連鎖的，所以， 位于Hfr染色體上前面的基因?qū)⒂懈嗟?機(jī)會(huì)出現(xiàn)在 F-中，越是后端的基因出現(xiàn)的機(jī)會(huì)就越少。因此，根據(jù)細(xì)菌結(jié)合后F-菌中Hfr上的基因出現(xiàn)的多少就可以測(cè)定基因間的相對(duì)位置。實(shí)驗(yàn)中采用選擇培養(yǎng)基篩選法，即親本不能生長(zhǎng)，只有重組子可以生長(zhǎng)，同時(shí)可利用營(yíng)養(yǎng)物的加入選擇不同的重組子。三、實(shí)

4、驗(yàn)用具及材料1）菌株供體菌:E.coli CSH60 Hfr str s受體菌：E.coli 57B F-缺陷型rmet-leu-trp-his-arg-lac-gal-ade-ilv-str2）實(shí)驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基1. 液體BP培養(yǎng)基，10 >A磷酸緩沖液，生理鹽水，200.0g/L糖溶液，0.25M硫酸鎂溶液， 鹽酸硫胺素（VBI）,鏈霉素溶液，氨基酸溶液及腺喋吟2. 平板培養(yǎng)基：見表 1 o表1培養(yǎng)基配表少口開至選擇標(biāo)記碳源StrArgIlvMetLeuAdeTrpHisAmet leu str葡萄糖+一一+Barg (met leu str)葡萄糖+一+一一+Cade (met le

5、u str)葡萄糖+一一一+Dtrp (met leu str)葡萄糖+一一+一+Ehis (met leu str)葡萄糖+一一+一Flac (met leu str)乳糖+一一+Ggal (met leu str)半乳糖+一一+將培養(yǎng)基配制完成后，在超凈工作臺(tái)將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，待培養(yǎng)基冷凝后備用。3）其他用具三角瓶、試管、燒杯、培養(yǎng)皿、取液器、接種環(huán)、涂棒、牙簽、體積分?jǐn)?shù)70%酒精。四、實(shí)驗(yàn)操作1. 活化菌種：實(shí)驗(yàn)前，從冰箱內(nèi)取出保存的受體及供體菌種在37C下活化24h ,然后分 別用接種針挑一環(huán)菌至 5mLBP液體培養(yǎng)基中在 37C、200r/min下震蕩培養(yǎng)16h。2. 擴(kuò)

6、大培養(yǎng)：從上述 5mL培養(yǎng)液中用取液器分別吸取供體和受體菌1mL裝入到另一新的5mL培養(yǎng)基內(nèi)，在 37 C下培養(yǎng)23h。此時(shí)，從供體和受體的培養(yǎng)瓶中分別取0.1mL菌液均勻涂布在A平板培養(yǎng)基上作為對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于37 C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。3. 雜交：用取液器從擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液中分別吸取供體菌0.2mL、受體菌4mL混合于一個(gè) 三角瓶?jī)?nèi)，將其置于搖床 37C、200r/min下震蕩培養(yǎng)1.5h。4. 雜交菌液培養(yǎng)：雜交結(jié)束后，從雜交液中吸取 0.1mL到A培養(yǎng)皿上，用涂棒將雜交液 涂布均勻。5. 稀釋涂布：分別涂布兩個(gè)稀釋5倍和10倍的A平板培養(yǎng)基，置于 37 C溫箱倒置培養(yǎng)。6. 用無(wú)菌的

7、牙簽挑取 A平板上的菌落，分別接種在BG選擇培養(yǎng)基的對(duì)應(yīng)位置上，最后在選擇培養(yǎng)基上接種的菌落數(shù)達(dá)到110。7. 將接種好的選擇培養(yǎng)基平板置于37C下恒溫培養(yǎng)，待有菌落長(zhǎng)出時(shí)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)統(tǒng) 計(jì)結(jié)果將大腸桿菌的幾個(gè)連鎖的基因作出線性排列的位置順序圖。五、結(jié)果與討論1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果少口開至B(arg)C(ade)D(trp)E(his)F(lac)G(gal)總數(shù)生長(zhǎng)菌 數(shù)8-12613581221211258-2253修正為315107修正為106110總數(shù)41146613229227235重組率0.0170.4850.2810.0550.9740.9661附：重組率=（選擇性培養(yǎng)基

8、生長(zhǎng)菌數(shù)/點(diǎn)總菌數(shù)）X100%D板戳的洞很大，計(jì)數(shù)時(shí)偏大，修正為 31。G板我們的菌落數(shù)很少，和其他組結(jié)果 都有所不同，估計(jì)是點(diǎn)菌時(shí)沒有點(diǎn)上，修正為110。2 .計(jì)算基因間的圖距由于圖距與重組率的倒數(shù)有較好的線性相關(guān)關(guān)系，由此以ori到lac的圖距定義為1,則計(jì)算如下表2相對(duì)圖距的計(jì)算基因lacgaladetrphisArg重組率0.970.970.490.280.060.021/重組率1.031.042.063.5618.0858.75相對(duì)圖距1.001.012.013.4717.6257.253. 繪制大腸桿菌連鎖基因圖由表 1 得到 arg, ade, trp, his, lac, ga

9、l, met 和 leu 從近到遠(yuǎn)的排列順序?yàn)椋海╩et-leu）-lac-gal-ade- trp-his-arg ,并由表二得各基因相對(duì)圖距作大腸桿菌連鎖基因圖如下：圖1實(shí)驗(yàn)得到的大腸桿菌連鎖基因圖圖2大腸桿菌的遺傳圖示結(jié)果評(píng)價(jià)：（用遺傳書的Figure15.16作對(duì)照。）由圖可見，前面的基因相對(duì)位置較為符合，而后面的基因因?yàn)樘h(yuǎn)，這種計(jì)算方法不是那么適合，所以應(yīng)該選擇不同的Hfr實(shí)驗(yàn)。5.關(guān)于非中斷雜交和中斷雜交：中斷雜交是比較普遍的用于測(cè)定大腸桿菌基因分布的 方法，它的操作相對(duì)復(fù)雜，但是能得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。右圖是一個(gè)中斷雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖：由于染色體是線性傳導(dǎo)的，假設(shè)傳導(dǎo)速度一樣，那么

10、橫坐標(biāo)時(shí)間就和基因相對(duì)。點(diǎn)的位置成正比。而非中斷雜交的結(jié)果，其實(shí)相當(dāng)于縱坐標(biāo)，即足夠長(zhǎng) 的時(shí)間后進(jìn)入并與標(biāo)記基因一起重組的概率，這個(gè)概 率也是和圖距正相關(guān)的。一種由非中斷雜交得到圖距的計(jì)算方式，是直接用1減去重組率，以右圖的橫縱坐標(biāo)對(duì)照可知，這樣計(jì)算 結(jié)果誤差較大，于是實(shí)驗(yàn)采用的是1/重組率法。不管是中斷雜交，還是非中斷雜交，都存在兩個(gè)基因相距太近時(shí)和基因離 O點(diǎn)太遠(yuǎn)時(shí)測(cè)量不準(zhǔn)的問(wèn)題，前 者可以通過(guò)重組進(jìn)行精細(xì)定位，后者可以通過(guò)不同Hfr菌株配合實(shí)驗(yàn)得到較準(zhǔn)確的結(jié)果。六、實(shí)驗(yàn)小結(jié)TlmB(minLrtjBS)圖3中斷雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)是在別的實(shí)驗(yàn)中“插空”做的，但每一步也都有其重要性

11、和要點(diǎn)。第一周：配置培養(yǎng)基等準(zhǔn)備工作。這一步是最簡(jiǎn)單的， 很好地體現(xiàn)了大合作的特點(diǎn)，自己要對(duì)自己的工作非常清楚，但別人做了什么就只知道個(gè)大概了。第二周：雜交，涂 A板。這一步要求無(wú)菌操作， 我們使用的是酒精燈提供局部無(wú)菌環(huán)境，要注意“有菌的不碰無(wú)菌的，無(wú)菌的也不要碰無(wú)菌的”，對(duì)于這次實(shí)驗(yàn)而言，由于培養(yǎng)基中是含抗生素的，所以無(wú) 菌操作意義不是那么大， 但是作為對(duì)無(wú)菌操作的一次練習(xí)還是應(yīng)該認(rèn)真：首先，滅過(guò)菌的容器內(nèi)應(yīng)該考慮為有菌，而所有可以和外界空氣接觸的部分就算有菌了 ；其次操作過(guò)程中不僅僅是不碰，最好有菌的東西都不要直接經(jīng)過(guò)無(wú)菌的上方；最后，一切無(wú)菌操作需保持在酒精 燈有效范圍內(nèi)，但又要注意塑

12、料制品不可靠火焰太近。第三周：點(diǎn)菌、統(tǒng)計(jì)。點(diǎn)菌的時(shí)候幾乎沒有考慮無(wú)菌環(huán)境，因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)有抗生素，不擔(dān)心細(xì)菌污染，而真菌如果要生長(zhǎng)的話需要時(shí)間較長(zhǎng)，而我們的實(shí)驗(yàn)3天就可以看結(jié)果了。點(diǎn)菌要注意的是牙簽不要插得太深，否則計(jì)數(shù)時(shí)會(huì)搞不清是牙簽印還是菌落。但是又要保證碰到， 不然可能沒有點(diǎn)上。一根牙簽要點(diǎn)六塊板，點(diǎn)到后三塊時(shí)菌濃度肯定更低了，所以要用牙簽的另一面點(diǎn)菌。因?yàn)槭墙y(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，所以不需要太嚴(yán)格地一根牙簽點(diǎn)六塊板，但是從誤差分析角度考慮， 這樣點(diǎn)誤差要相對(duì)小一些。統(tǒng)計(jì)的時(shí)候一定要四個(gè)人一起，在有疑問(wèn)的時(shí)候才能更好地討論。我們的經(jīng)驗(yàn)是，反面不確定就看正面?zhèn)让妫瑥亩鄠€(gè)角度觀察，菌落會(huì)比較潮濕而且稍微比培

13、養(yǎng)基高，還是可以和牙簽印分開的；對(duì)于長(zhǎng)了霉菌的也是用這個(gè)方法，霉菌菌落的形態(tài)和大腸桿菌是不同的，仔細(xì)從不同角度觀察可以判斷霉菌菌落旁有沒有蓋著大腸桿菌菌落。七、思考1. 什么是高重組品系？答：F+菌株和F-菌株雜交將產(chǎn)生 F+菌株后代（約70%），而發(fā)生基因重組的頻率為 10-7。當(dāng) F因子整合入細(xì)胞染色體的時(shí)候， 產(chǎn)生了高頻重組的 Hfr品系，高頻重組品系和F+菌株有相 似的雜交特性，但和 F-菌株雜交時(shí)發(fā)生重組的頻率為 IO-4,并產(chǎn)生后代為F-菌株。2. 以大腸桿菌為例說(shuō)明原核生物與真和生物基因傳遞和重組的異同。答：相同點(diǎn)：都是異源 DNA進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程。不同點(diǎn)：原核細(xì)胞傳遞基因主要靠三

14、種方式：轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)。真核生物有兩種：親代和 子代間靠減數(shù)分裂和受精作用，外源基因轉(zhuǎn)入一般發(fā)生在病毒感染過(guò)程中。基因重組方面，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的DNA重組都發(fā)生在同源區(qū)段，以利配對(duì)。但原核生物的基因重組發(fā)生的時(shí)間比較隨意，重組率低；而真核生物的基因重組需要發(fā)生在特定的細(xì)胞時(shí)相（減I前期的交叉互換，及減 I后期的自由組合），并且重組率相對(duì)較高。此外，大 腸桿菌重組形成部分二倍體或部分合子，且只有偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生平衡的重組子，相反的重組子不會(huì)出現(xiàn)。3. 如何證明細(xì)菌重組是由雜交產(chǎn)生的，而不是由回復(fù)突變產(chǎn)生的？答：在雜交之前將兩個(gè)親本各涂這樣一組板作為control，結(jié)是這兩個(gè)親本在 AG培養(yǎng)基上都不生長(zhǎng)，即可證。4. 如何證明細(xì)菌的接合是異宗配合？答：可準(zhǔn)備兩組雜交,如a. F+ lac" F- lac- ;b. F+ lac+（F- lac-,結(jié)果 a. lac+, b. lac-就說(shuō)明配合過(guò)程中，基因只從“雄性F+”細(xì)菌傳遞到了 “雌性 F-”細(xì)菌，而不能按相反的方向傳遞。5. F+菌株Hfr菌株分別與F-菌株雜交產(chǎn)生重組頻率不同的原因是什么？答：對(duì)Hfr X F-接合來(lái)說(shuō)，早轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的