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認(rèn)證類型：個(gè)人認(rèn)證

認(rèn)證主體：劉**（實(shí)名認(rèn)證）

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IP屬地：天津 上傳時(shí)間：2021-12-12 格式：DOCX 頁(yè)數(shù)：8 大?。?2.69KB 積分：15 舉報(bào) 版權(quán)申訴

1、定點(diǎn)突變?cè)噭┖袘?yīng)'定點(diǎn)突變?cè)噭┖?概述：定點(diǎn)突變?cè)噭┖锌梢栽诳寺∮谫|(zhì)粒DNA序列的特定位點(diǎn)誘導(dǎo)突變。理論上可以保證突變率達(dá)到100%整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單快捷只需要兩個(gè)步驟。試劑盒不需要用到M13載體和甲基化步驟。該試劑盒可以誘導(dǎo)某個(gè)已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變、再突變成野生型、密碼子突變、插入或者缺失等，因此可以用于功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。另外由于試劑盒能夠誘導(dǎo)特異基因突變，又可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程學(xué)研 究領(lǐng)域。定點(diǎn)突變?cè)噭┖胁僮魇趾?jiǎn)單(根據(jù)我們提供的引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物；用Muta-directTM酶進(jìn)行1518個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)；MutazymeTM酶處理選擇突變克??；轉(zhuǎn)

2、化)。理論上在LB平板上的克隆100%是突變克隆，通過對(duì)突變克隆的測(cè)序分析，正確的突變可以應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。目錄號(hào)規(guī)格價(jià)格SDM-1515次950元p| LnWlVWIIMnLU配燈：H MjT A ili=布嚀J.=:ra c aiprtE-n,i osl-qv ft'.!» rit-產(chǎn)品特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊的實(shí)驗(yàn)技能23天即可完成基因的定點(diǎn)突變整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程只需要用到兩種酶：Muta-directTM酶和MutazymeTM酶使用范圍廣泛：可以用于點(diǎn)突變(P o i n t mutation )、缺失突變(Deletion )和插入突變(Insertion)等100%的突

3、變效率貯存條件：請(qǐng)將試劑盒中提供的各種試劑貯存于-20C。由于試劑盒中提供的反應(yīng)緩沖液及dNTP是為反應(yīng)專門優(yōu)化的，所以不要用其它的反應(yīng)緩沖液及dNTP代替。試劑盒組成:試劑盒提供的對(duì)照模板及引物，可以完成5次對(duì)照實(shí)驗(yàn)。包括對(duì)照反應(yīng)在內(nèi)，本試劑盒共可進(jìn)行10815次基因定點(diǎn)突變反應(yīng)（每次反應(yīng)體系50卬o組成次量Muta - DirectTMEnzyme (2.5U/ 卬 1)15 g1Muta-DirectTMReaction Buffer (10) x100g 1dNTP Mixture30 卬1pUC18 Control Plasmid (10ng/ 卬 l)10 g 1Control P

4、rimer Mix (20pmol/ 卬 l)10 g 1Competent cellsNot provided定點(diǎn)突變對(duì)照實(shí)驗(yàn)：試劑盒中提供的對(duì)照質(zhì)粒為 pUC18，通過它可 以判斷實(shí)驗(yàn)的成功與否。pUC18質(zhì)粒包含Lac Z基因，用 試劑盒中提供的對(duì)照引物可以誘導(dǎo)pUC18中絲氨酸（TCG）突變?yōu)榻K止密碼子（TAG），這樣會(huì)導(dǎo)致LacZ基因失活，因此LB平板上的克隆必須都為白色才證明突變成功。對(duì)于首次做突變實(shí)驗(yàn)的用戶，可以通過對(duì)照反應(yīng)觀察實(shí)驗(yàn)是否成功。引物設(shè)計(jì):首先需要進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)時(shí)請(qǐng)參考如下原則通常引物長(zhǎng)度為2545mer,我們建議引物長(zhǎng)度 注：突變位點(diǎn)應(yīng)該設(shè)計(jì)在引物的中央位置。如

5、果設(shè)定的引物長(zhǎng)度為 30mer,接下來(lái)需要計(jì)40%）。如果Tm值低于78C,則適當(dāng)改變引物的長(zhǎng)度 設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中央為 3035mer。算引物的Tm值，看是否達(dá)到 78C （GC含量 應(yīng)大于以使其Tm值達(dá)到78 C （GC含量應(yīng)大于40%）。 位置。 計(jì)算引物的 Tm值，看是否達(dá)到 78C,如果Tm值低于78C，則適當(dāng)改變引物的長(zhǎng)度以使其Tm值達(dá)到78 C （GC含量應(yīng)大于40%）。 最好使用經(jīng)過純化的引物。Tm值計(jì)算公式： Tm=0.41 ）（% of GC）-675/ L+81.5注：L:引物堿基數(shù)；% of GC:引物 GC含量。引物設(shè)計(jì)實(shí)例:以GC& ACG

6、 為例:5'-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3' 首先設(shè)計(jì)30mer長(zhǎng)的上下游引物，并將 A（T）設(shè)計(jì)在引物的中央位置。Primer #1: 5'-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC- 3'Primer #2: 5'-GCAATAAGTAAGTCGTCTAATACTGAAGG-3' 引物GC含量為40%, L為30,將這兩個(gè)數(shù)值帶入 Tm值計(jì)算公式，得到其 Tm=75.5 （Tm=0.41x 40-675/30+81.5）。通過計(jì)算可以看出其 Tm低于78C,這樣的引物是不合適的

7、，所以必須調(diào)整引物長(zhǎng)度。 重新調(diào)整引物長(zhǎng)度。Primer #1: 5'-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3'Primer #2: 5'CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3'在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%, L值為35,將這兩個(gè)數(shù)值帶入 Tm 值，計(jì)算公式，得到其 Tm為80.952 （Tm=0.41X47.5-675/35+81.5）,這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗(yàn)了。實(shí)驗(yàn)前注意事項(xiàng)：試劑盒提供了優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案，按步驟操作誘導(dǎo)目的基因突變率幾乎可達(dá)1

8、00% o白色菌落的形成與突變效率是不同的，在實(shí)驗(yàn) 過程中重要的是出現(xiàn)白色單菌落而不是菌落出現(xiàn)的數(shù)量。如果出現(xiàn)白色菌落則證明在目的基因上已經(jīng)發(fā)生了突變。有時(shí)由于 MutazymeTM 處理步驟的失誤，殘留的模板質(zhì)粒也能形成白色菌落。但如果您操作無(wú)誤，這種情況一般不會(huì)發(fā)生。白色菌落的數(shù)量與突變率是沒有直接關(guān)系的，而與PCR反應(yīng)條件和感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率有關(guān)。如果突變沒有出現(xiàn)在目的核昔上時(shí)，請(qǐng)檢測(cè)合成引物的純度。當(dāng)PCR反應(yīng)完成后，MutazymeTM酶的用量就 會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若模板過量會(huì)產(chǎn)生陰性結(jié)果，因此MutazymeTM和質(zhì)粒模板的用量必須適當(dāng)。試劑盒適用于15kb甚至大于15kb的模板突

9、變，但是當(dāng)所用的質(zhì)粒模板大于10kb時(shí)，白色菌落 數(shù)量會(huì)減少，不過這與突變效率沒有關(guān)系。定點(diǎn)突變操作步驟：A誘導(dǎo)突變基因（PCR反應(yīng)）以待突變的質(zhì) 粒為模板，用設(shè)計(jì)的引物及 Muta-directTM酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，誘導(dǎo)目的基因突變。1. 設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。注參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)2. 準(zhǔn)備模板質(zhì)粒DNA注用dam+型菌株（例如 DH5 a菌株）作為宿主菌。在 end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)象，但是對(duì)突 變效率沒有影響。提取質(zhì)粒DNA時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純?cè)噭┖小?. 選項(xiàng)對(duì)照反應(yīng)體系（501反應(yīng)體系）5 ii 110x reaction buffer2 p, 1pUC18 con

10、trol plasmid (10ng/ 心 total 20ng)Control primer mix (20pmol/g 12 g 1dNTP mixture (each 2.5mM)2 g 1dH2O38 卬1Muta-directTM Enzyme1 卬 14. 樣品反應(yīng)體系(50反應(yīng)體系)10x reaction buffer5 卬 1Sample plasmid (10ng/ 心total 20ng)2 g 1Sample primer (F)(10pmol/卬 l)1 g 1Sample primer (R) (10pmol/卬 l)1 g 1dNTP mixture (each

11、2.5mM)2 g 1dH2O38 i1Muta-directTM Enzyme38 卬15. PCR反應(yīng)條件注按如下參數(shù)設(shè)置PCR擴(kuò)增條件。CyclesTemperanceReaction Time1 cycle95 C30$ec95 C30sec15 cycles55 CIniin721：Imin per plasmid Kb6. PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后冰育 5分鐘，然后置于室溫（避免反復(fù)凍融）。注按下列提供的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，控制PCR循環(huán)數(shù)。注意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過 4個(gè)時(shí)會(huì)發(fā)生突變率 降低的現(xiàn)象。MutationCycles1-2 Nucleotides15 cycles3 Nucleo

12、tides18 cyclesB突變質(zhì)粒選擇PCR反應(yīng)結(jié)束后使用 MutazymeTM酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒 DNA。1. 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)產(chǎn)物。2. 加入 偵1（ 10U/H MutazymeTM 酶37C溫育1小時(shí)。注當(dāng)質(zhì)粒DNA用量過多時(shí)MutazymeTM酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為 了保證突變率請(qǐng)嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。如果突變率低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或增加MutazymeTM酶用量。C轉(zhuǎn)化反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒 DNA上會(huì)產(chǎn)生缺口，當(dāng)把 這個(gè)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入E.coli中時(shí)請(qǐng)選擇dam+型菌株， 例 如DH成。1. 將10g樣品加到50卬感受態(tài)細(xì)胞里，然后放置

13、在冰上30分鐘。2. 接下來(lái)可以參照一般的轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。序列分析：通常當(dāng)LB平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。為了證實(shí)這一結(jié)果，我們建議對(duì)白色單菌落進(jìn)行測(cè)序分析。突變實(shí)例:以GGC> GAC 為例突變反應(yīng)體系0 Reaction buffer5 卬 1Sample plasmid (6.3Kb , 10ng/ 心 total 20ng)2 g 1Sample primer (F)(10pmol/卬 l)1 g 1dNTP mixture (2.5mM each)1 g 1dH2O38 卬1Muta-directTM Enzyme38 卬1PCR條件Cyc lesT emperanneReaction Time1 cycle95