SOD酶的純度分析及活力測定-修

1、超氧化物歧化酶的活力測定超氧化物歧化酶的活力測定老老 師：師： 余子全余子全研究生：徐沙研究生：徐沙 劉雪梅劉雪梅目的：學習并掌握測定超氧化物歧化酶活力的原理目的：學習并掌握測定超氧化物歧化酶活力的原理 及方法。及方法。內(nèi)容：內(nèi)容：1.超氧化物歧化酶活力測定的原理。超氧化物歧化酶活力測定的原理。 2.超氧化物歧化酶的活力測定實驗。超氧化物歧化酶的活力測定實驗。1.材料：從黃豆中提取的SOD酶、SOD酶標準品。2.儀器：恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、微量進樣器、試管。3.試劑：(1)pH 8.2 50mM Tris-HCl緩沖液；(2)50mM 鄰苯三酚；(3)10mM HCl。4.試劑的配置(1

2、)pH8.2 50 mM Tris-HCl緩沖液Tris 0.61gEDTA 0.037g加雙蒸水約80ml，充分溶解后，用HCl調(diào)pH至8.2，定容至100ml。(2)50mM 鄰苯三酚鄰苯三酚 0.063g用10mM HCl溶解，定容至10ml，現(xiàn)配先用，避光保存。(3)10mM HCl在一般情況下，在一般情況下，SOD活性測定只能應用活性測定只能應用間接活性間接活性測定法測定法。其測定其測定方法很多，常見的有方法很多，常見的有化學法化學法、免疫法、免疫法和等電點聚焦法和等電點聚焦法 ，其中化學法應用最普遍其中化學法應用最普遍?；瘜W法的化學法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產(chǎn)生有

3、原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產(chǎn)生有色中間物和色中間物和O2 -，利用，利用SOD分解而間接推算酶活力。分解而間接推算酶活力。在化學方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰在化學方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學發(fā)光法，腎上腺素法，苯三酚法，化學發(fā)光法，腎上腺素法，NBT-還原法，還原法，光化學擴增法，光化學擴增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實用。本實驗采用自氧化法簡單易行較為實用。本實驗采用鄰苯三酚自鄰苯三酚自氧化方法氧化方法。鄰苯三酚簡介鄰苯三酚簡介 鄰苯三酚又名焦性沒食子鄰苯三酚又名焦性沒食子酸，白色有光澤結(jié)

4、晶體，加熱酸，白色有光澤結(jié)晶體，加熱時易升華，需避光保存。在露時易升華，需避光保存。在露光的空氣中會逐漸變成淡灰光的空氣中會逐漸變成淡灰色，水溶液在空氣中逐漸變色，水溶液在空氣中逐漸變暗，在堿性溶液中迅速變暗暗，在堿性溶液中迅速變暗 ，易溶于水、醇、醚，微溶于易溶于水、醇、醚，微溶于苯、氯仿、二硫化碳。對皮苯、氯仿、二硫化碳。對皮膚、粘膜的刺激性極強。作為化學試劑，主要用作膚、粘膜的刺激性極強。作為化學試劑，主要用作作還原劑。作還原劑。 鄰苯三酚自氧化法鄰苯三酚自氧化法原理原理：鄰苯三酚在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，但在堿性條件鄰苯三酚在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，但在堿性條件下，能迅速自氧化，自氧化過程中只接受

5、一個電下，能迅速自氧化，自氧化過程中只接受一個電子生成子生成O2 - (超氧陰離子自由基超氧陰離子自由基)，同時生成顏色中，同時生成顏色中間產(chǎn)物間產(chǎn)物(紅桔酚紅桔酚)，反應開始后反應液先變成黃綠色，反應開始后反應液先變成黃綠色，幾分鐘后轉(zhuǎn)為黃色，線性時間維持在幾分鐘后轉(zhuǎn)為黃色，線性時間維持在34分鐘。分鐘。鄰鄰苯三酚的自氧化速率與生成的苯三酚的自氧化速率與生成的O2 -的濃度呈正相關，的濃度呈正相關，故可以通過紫外可見分光光度計來定量測定抗氧故可以通過紫外可見分光光度計來定量測定抗氧化劑在此體系中對化劑在此體系中對O2 -的清除作用，間接評價抗氧的清除作用，間接評價抗氧化劑的抗氧化能力?；瘎┑?/p>

6、抗氧化能力。本實驗中測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的本實驗中測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階初始階段段，中間物的積累在滯留，中間物的積累在滯留3045s后，與時間成后，與時間成線性線性關系關系，一般線性時間維持在，一般線性時間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物的范圍內(nèi)，中間物在在325nm波長處有強烈光吸收。當有波長處有強烈光吸收。當有SOD存在時，存在時，由于它能催化由于它能催化O2 -與與H+結(jié)合生成結(jié)合生成O2和和H2O2，從而阻，從而阻止了中間有色產(chǎn)物的積累，導致吸光值下降因此，止了中間有色產(chǎn)物的積累，導致吸光值下降因此，通過測定它們在特定波長下的光吸收變化速率計算通過測定它們在特定波長

7、下的光吸收變化速率計算出出SOD的酶活性的酶活性 。 鄰苯三酚鄰苯三酚 O2 - + 紅桔酚紅桔酚 (自氧化：有色物質(zhì)積累，吸光值增加自氧化：有色物質(zhì)積累，吸光值增加) O2 - + O2 - + 2H+ H2O2+ O2(SOD催化：阻止中間產(chǎn)物積累，吸光值降低催化：阻止中間產(chǎn)物積累，吸光值降低) pH=8.2SOD 3.2 SOD酶活力計算：酶活力計算： 酶活力單位定義酶活力單位定義:在一定條件下在一定條件下,每每1ml反應液中每分鐘抑反應液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達制鄰苯三酚自氧化速率達50 %時的酶量定義為一個活力時的酶量定義為一個活力單位。單位。 鄰苯三酚的自氧化曲線鄰苯三酚的自氧化曲線(25 pH8.2Tris-HCl緩沖液緩沖液4.5mL 45mL鄰苯三酚溶液鄰苯三酚溶液0.01mL)BackSOD酶對鄰苯三酚自氧化的抑制酶對鄰苯三酚自氧化的抑制 酶活力測定曲線酶活力測定曲線Back注意事項：注意事項：1.加入鄰苯三酚后，后續(xù)操作要迅速，最好能在加入鄰苯三酚后，后續(xù)操作要迅速，最好能在30s45s之內(nèi)完成。之內(nèi)完成。2.鄰