酶免檢測技術(shù)原理及影響PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1酶免檢測技術(shù)原理及影響酶免檢測技術(shù)原理及影響第1頁/共39頁檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)項(xiàng)目普免術(shù)前四項(xiàng)（普免）術(shù)前四項(xiàng)（急篩復(fù)查）體檢AFPCEA體檢HAV(IgM)HEV(IgM、IgG)HBcAbTAP化學(xué)發(fā)光腫瘤性激素HCG貧血三項(xiàng)胰島素C-肽自身免疫自免肝四項(xiàng)ENA譜抗核抗體抗線粒體抗體血管炎過敏原呼吸道HIV初篩實(shí)驗(yàn)室迎檢任務(wù)前景展望檢測方面：免疫球蛋白、補(bǔ)體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、免疫移植等，技術(shù)方面：電泳技術(shù)、細(xì)胞技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞技等教學(xué)方面：華信臨床檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)第2頁/共39頁工作人員工作人員 姓名姓名職稱職稱職務(wù)職務(wù)職責(zé)職責(zé)狀態(tài)狀態(tài)孫文鮮孫文鮮主管檢驗(yàn)技師主管檢驗(yàn)技師常

2、規(guī)免疫常規(guī)免疫免疫室組長免疫室組長固定人員固定人員劉麗娜劉麗娜主管檢驗(yàn)技師主管檢驗(yàn)技師發(fā)光免疫發(fā)光免疫免疫室質(zhì)控管理員免疫室質(zhì)控管理員固定人員固定人員史可史可檢驗(yàn)師檢驗(yàn)師自身免疫自身免疫免疫室生物安全及免疫室生物安全及感染控制管理員感染控制管理員固定人員固定人員馮凡馮凡檢驗(yàn)員檢驗(yàn)員常規(guī)免疫常規(guī)免疫免疫室儀器維護(hù)免疫室儀器維護(hù)及信息管理員及信息管理員固定人員固定人員夜班人員夜班人員科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干科室骨干暫時固定暫時固定堅(jiān)持兩個原則：堅(jiān)持兩個原則：1 1、堅(jiān)持檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、及時性、有效性、堅(jiān)持檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、及時性、有效性 2 2、堅(jiān)持以病人為中心，全心全心全意服務(wù)

3、病人、堅(jiān)持以病人為中心，全心全心全意服務(wù)病人第3頁/共39頁免疫室日常工作量免疫室日常工作量（3 3月月2323日為例）日為例）項(xiàng)目標(biāo)本量（人份）項(xiàng)目包括內(nèi)容備注普篩88門診、病房普篩，乙肝五項(xiàng)（ 酶免法）急篩復(fù)查47所有急篩（酶免法）發(fā)光51腫瘤、性激素、貧血三項(xiàng)、胰島素、C-肽、HCG體檢37AFP、CEA、乙肝五項(xiàng)、丙肝、普篩自免3自身免疫、呼吸道、過敏原、雜項(xiàng)9TB、HP、TAP、HPV、HAV、HEV、HBcAb-IgM總計(jì)234第4頁/共39頁免疫室特殊項(xiàng)目檢測成本免疫室特殊項(xiàng)目檢測成本項(xiàng)目成本（）項(xiàng)目成本（）項(xiàng)目成本（）項(xiàng)目成本（）備注AFP66.29FSH66.29Ferr52

4、.51呼吸道63.98CEA66.29LH66.29Foll89.97過敏原69.63CA15374.76P66.29B1290.05抗核抗體66.60CA19985.59T66.29胰島素67.94抗ds-DNA158.20CA12585.59PRL66.29C-肽62.20抗平滑肌抗體69.69FPSA85.59E266.29自免肝55.02ENA譜57.50TPSA85.59HCG66.29血管炎61.70抗線粒體抗體待定注：此統(tǒng)計(jì)結(jié)果可信度為95第5頁/共39頁第6頁/共39頁第7頁/共39頁第8頁/共39頁氫鍵結(jié)合力氫鍵結(jié)合力范德華引力范德華引力靜電引力靜電引力疏水作用力疏水作用力抗

5、抗原原抗抗體體結(jié)結(jié)合合力力第9頁/共39頁抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)：抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)：1 1、特異性、特異性 2 2、比例性、比例性 3 3、可逆性、可逆性抗原抗體反應(yīng)影響因素：抗原抗體反應(yīng)影響因素：1 1、反應(yīng)物自身因素：抗原、反應(yīng)物自身因素：抗原 抗體抗體2 2、反應(yīng)環(huán)境條件：電解質(zhì)、反應(yīng)環(huán)境條件：電解質(zhì) 酸堿度酸堿度 溫溫 度度抗原抗體反應(yīng)影響因素：抗原抗體反應(yīng)影響因素：1 1、反應(yīng)物自身因素：、反應(yīng)物自身因素： 抗原抗原 理化性狀、表位種類、數(shù)目理化性狀、表位種類、數(shù)目 抗體抗體 來源、特異性、親和性、效價來源、特異性、親和性、效價2 2、反應(yīng)環(huán)境條件：、反應(yīng)環(huán)境條件： 電解質(zhì)電解質(zhì) 85g/

6、LNaCl85g/LNaCl溶液溶液 酸堿度酸堿度 pH6-9pH6-9為宜為宜 溫溫 度度 最適溫度為最適溫度為3737第10頁/共39頁二、酶免疫技術(shù)的分類、特點(diǎn)及原理二、酶免疫技術(shù)的分類、特點(diǎn)及原理第11頁/共39頁酶酶免免疫疫技技術(shù)術(shù)酶免疫組化酶免疫組化組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位 酶免疫測定酶免疫測定液體標(biāo)本中抗原或液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量抗體的定性和定量均相均相 異相異相固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相液相酶免疫測定酶免疫測定1、酶放大免疫測定技術(shù)EMIT2、克隆酶供體免疫分析CEDIA分離結(jié)合、游離酶標(biāo)記物，底物測定檢測微量短肽激素、小分子

7、抗原最廣泛，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)小分子激素、半抗原測定第12頁/共39頁酶免技術(shù)的分類酶免技術(shù)的分類2 2、酶免技術(shù)特點(diǎn)、酶免技術(shù)特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的特異性抗原抗體反應(yīng)的特異性 +酶高效催化反應(yīng)的專一性酶高效催化反應(yīng)的專一性主要試劑主要試劑: : 酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：酶標(biāo)物特點(diǎn)： 免疫學(xué)活性免疫學(xué)活性 酶對底物的催化活性酶對底物的催化活性第13頁/共39頁第14頁/共39頁第15頁/共39頁原理原理包被包被12反應(yīng)反應(yīng)加入待測抗體或加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原抗原和酶標(biāo)抗原或抗體或抗體3洗滌洗滌使結(jié)合在固相上使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離與未

8、結(jié)合的分離4底物顯色底物顯色定性或定量的分析定性或定量的分析三個必要試劑三個必要試劑 固相的抗原或抗體固相的抗原或抗體 酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物） 酶反應(yīng)的底物酶反應(yīng)的底物 第16頁/共39頁雙抗體夾心法（測抗原）雙抗體夾心法（測抗原） 方法：方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色，加底物顯色 應(yīng)用：應(yīng)用：二價或二價以上的較大分子抗原測定二價或二價以上的較大分子抗原測定 HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、甲胎蛋白、甲胎蛋白、HCGHCG等等2 2、方法類型及反應(yīng)原理方法類型及反應(yīng)原理第17頁/共39頁雙位點(diǎn)一

9、步法（測抗原）雙位點(diǎn)一步法（測抗原） 方法：方法：用單克隆抗體做成固相抗體和酶標(biāo)抗體，待測抗用單克隆抗體做成固相抗體和酶標(biāo)抗體，待測抗原酶標(biāo)抗原同時加入，加底物顯色原酶標(biāo)抗原同時加入，加底物顯色 應(yīng)用：應(yīng)用：與雙抗體夾心法相似，提高了特異性、靈與雙抗體夾心法相似，提高了特異性、靈敏度，需注意敏度，需注意“鉤狀效應(yīng)鉤狀效應(yīng)”第18頁/共39頁方法類型及反應(yīng)原理方法類型及反應(yīng)原理第19頁/共39頁雙抗原夾心法雙抗原夾心法（測抗體）（測抗體） 原理：原理：類似雙抗體夾心法類似雙抗體夾心法 操作步驟操作步驟：類似類似 應(yīng)用：應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體乙型肝炎表面抗體方法類型及反應(yīng)原理方法類型及反應(yīng)原理第2

10、0頁/共39頁間接法間接法（測抗體）（測抗體） 方法方法用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗人人IgGIgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。（抗抗體或二抗）加底物顯色。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體 應(yīng)用應(yīng)用常用于常用于HCVHCV抗體、抗體、HIVHIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定測定第21頁/共39頁競爭法競爭法（測抗體）（測抗體） 原理：原理：類似檢測抗原的競爭法類似檢測抗原的競爭法 應(yīng)用應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)(HBcAb)和和

11、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗體抗體(HBeAb)(HBeAb)的檢測的檢測 第22頁/共39頁捕獲法捕獲法（測抗體）（測抗體） 應(yīng)用：應(yīng)用：病原體急性感染診斷中的病原體急性感染診斷中的IgMIgM型抗體型抗體 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗體抗體 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗體抗體第23頁/共39頁第24頁/共39頁1 1、標(biāo)本、標(biāo)本第25頁/共39頁第26頁/共39頁n加樣器定期校準(zhǔn)！加樣器定期校準(zhǔn)！第27頁/共39頁溫育溫度的選擇溫育溫度的選擇足夠的反應(yīng)時間足夠的反應(yīng)時間“邊緣效應(yīng)邊緣效應(yīng)”的排除的排除4 4、溫、溫 育育第28頁/共3

12、9頁第29頁/共39頁第30頁/共39頁第31頁/共39頁項(xiàng)目項(xiàng)目CUTOFFCUTOFF陽性判斷陽性判斷HIVHIV（科華）（科華）0.10.1MINMIN（PCxPCx，2.5)2.5)cutcutHIVHIV（麗珠）（麗珠）0.15+MAX(NCx,0.08)0.15+MAX(NCx,0.08)cutcut灰區(qū)又稱灰色帶反灰區(qū)又稱灰色帶反應(yīng)。就是把應(yīng)。就是把ODOD值在值在Cut offCut off值正負(fù)值正負(fù)20%20%這個范圍內(nèi)的標(biāo)本這個范圍內(nèi)的標(biāo)本稱為灰區(qū)標(biāo)本。這稱為灰區(qū)標(biāo)本。這個范圍稱為灰區(qū)。個范圍稱為灰區(qū)。. .灰區(qū)是客觀存在的，沒灰區(qū)是客觀存在的，沒有不存在灰區(qū)有不存在灰區(qū)

13、 的試劑，的試劑，我們只是盡量減少灰區(qū)我們只是盡量減少灰區(qū)的出現(xiàn)比例。的出現(xiàn)比例。. .減少灰區(qū)最有效的方法減少灰區(qū)最有效的方法就是盡量將板洗滌干凈就是盡量將板洗滌干凈。不同試劑盒不同試劑盒，CUTOFFCUTOFF值計(jì)算方法不同值計(jì)算方法不同例：第32頁/共39頁第33頁/共39頁ELISAELISA實(shí)驗(yàn)常見問題及解決方法實(shí)驗(yàn)常見問題及解決方法p類風(fēng)濕因子類風(fēng)濕因子：一般為IgM型，可與變性IgG Fc段非特異結(jié)合，因此可能與包被的IgG以及隨后加入的酶標(biāo)IgG結(jié)合而產(chǎn)生假陽性。p補(bǔ)體：補(bǔ)體：包被抗體及隨后加入的酶標(biāo)抗體均能激活補(bǔ)體而與補(bǔ)體C1q位點(diǎn)結(jié)合而產(chǎn)生假陽性，也可降低檢測物與固相結(jié)合

14、而引起假陰性或測值偏低p異嗜性抗體：異嗜性抗體：人血清中含有抗 齒類動物（羊、鼠等）Ig的抗體，即天然異嗜性抗體。與酶標(biāo)二抗出現(xiàn)假陽性。p溶菌酶：溶菌酶：可與等電點(diǎn)5的低等電點(diǎn)蛋白強(qiáng)結(jié)合，雙抗體夾心法ELISA可假陽性。p溶血溶血：Hb中的血紅素集團(tuán)有類似過氧化物的活性，溫育時吸附固相可與HRP顯色。p細(xì)菌污染：細(xì)菌污染：細(xì)菌分泌的一些酶可對抗原抗體蛋白分解或直接影響酶標(biāo)抗體作用，并且細(xì)菌引起標(biāo)本混濁。p標(biāo)本標(biāo)本44存放過久：存放過久：IgG聚合成二聚體，間接法中易假陽性。建議1:201:20準(zhǔn)確配置洗滌液1010、試劑盒運(yùn)輸時間太長，受高溫影響、試劑盒運(yùn)輸時間太長，受高溫影響夏天長途運(yùn)輸時，

15、縮短時間，低溫措施1111、試劑盒失效、試劑盒失效不適用失效試劑第35頁/共39頁現(xiàn)象可能原因解決方法重重復(fù)復(fù)性性差差1 1、樣品數(shù)量較多、加樣時間過長、樣品數(shù)量較多、加樣時間過長重復(fù)測定標(biāo)本時，盡可能使用同一移液器，裝緊吸嘴，條件、人員應(yīng)盡量與上次保持一致，以排除這些因素造成的重復(fù)性差的可能性。2 2、加樣量不一致、加樣量不一致3 3、孵育時間不一致、孵育時間不一致4 4、洗滌條件不同、洗滌條件不同5 5、操作人員不同、操作人員不同滿滿板板白，白，陽性陽性對照對照不顯不顯色色1 1、把終止液誤當(dāng)作酶結(jié)合物、或、把終止液誤當(dāng)作酶結(jié)合物、或底物使用底物使用嚴(yán)格按試劑說明書操作，加液時看準(zhǔn)標(biāo)簽，正確稀釋洗滌液，不要漏加試劑2 2、漏加試劑，如酶結(jié)合物、底物、漏加試劑，如酶結(jié)合物、底物A A、B B液液3 3、蒸餾水被污染，或盛洗滌液桶、蒸餾水被污染，或盛洗滌液桶被污染，留有使酶失活的物質(zhì)，被污染，留有使酶失活的物質(zhì)，換用合格水盛蒸餾水的瓶子要潔凈第36頁/共39頁現(xiàn)象可能原因解決方法滿滿板板顯顯色色