轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展綜述

1、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展綜述摘要：轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）作為一種新的高效、快捷的轉(zhuǎn)錄組研究手段正在改變著人們對轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識。RNA-Seq利用高通量測序技術(shù)對組織或細胞中所有RNA 反轉(zhuǎn)錄而成cDNA文庫進行測序，通過統(tǒng)計相關(guān)讀段(reads)數(shù)計算出不同RNA的表達量，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本；如果有基因組參考序列，可以把轉(zhuǎn)錄本映射回基因組，確定轉(zhuǎn)錄本位置、剪切情況等更為全面的遺傳信息，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、臨床研究和藥物研發(fā)等。文章主要比較近年來轉(zhuǎn)錄組研究的幾種方法和幾種RNA-Seq的研究平臺，著重介紹RNA-Seq的原理、用途、步驟和生物信息學(xué)分析，并就RNA-Seq技術(shù)面臨

2、的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展前景進行了討論及在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用等內(nèi)容，為今后該技術(shù)的研究與應(yīng)用提供參考。關(guān)鍵詞: RNA-Seq；原理應(yīng)用；方法；挑戰(zhàn)；發(fā)展前景Abstract：Transcriptome sequencing (RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome. RNA-Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of al

3、l RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads) numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence, the transcripts mapped to genomic, determine the position of the

4、transcription shear condition, more genetic information, has been widely used in biological research, medical research, clinical research and drug development. This paper compared several methods of platform transcriptome studies and several kinds of RNA-Seq in recent years, RNA-Seq focuses on the p

5、rinciple, purpose, steps and bioinformatics analysis, and discusses the RNA-Seq technology challenges and future development prospect and the application in related field and other content, provide the reference for the research and application of the technology future.Key word：RNA-Seq ;application;

6、 principle; method; challenge; development prospects前言：轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的集合。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量測序技術(shù)進行cDNA測序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本。隨著后基因組時代的到來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)相繼出現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)是率先發(fā)展起來以及應(yīng)用最廣泛的技術(shù) 1。遺傳學(xué)中心法則表明，遺傳信息在精密的調(diào)控下通過

7、信使RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質(zhì)。因此，mRNA被認(rèn)為是DNA 與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的一個“橋梁”，而所有表達基因的身份以及其轉(zhuǎn)錄水平，綜合起來被稱作轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)2。轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA(non-coding RNA， ncRNA)2, 3。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點, 了解轉(zhuǎn)錄組是解讀基因組功能元件和揭示細胞及組織中分子組成所必需的，并且對理解機體發(fā)育和疾病具有重要作用。整個轉(zhuǎn)錄組分析的主要目標(biāo)是：對所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行分類；確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，如其起始

8、位點，5和3末端，剪接模式和其他轉(zhuǎn)錄后修飾；并量化各轉(zhuǎn)錄本在發(fā)育過程中和不同條件下(如生理/病理)表達水平的變化2,3。在過去的十幾年里，雜交技術(shù)的發(fā)展，再加上以標(biāo)簽序列為基礎(chǔ)的方法的應(yīng)用，第一次使研究人員對這一領(lǐng)域有了深入的了解，但毋庸置疑，隨著新一代測序(Next-generation sequencing，NGS)平臺的市場化， RNA-Seq(RNA sequencing)技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)徹底改變了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的思維方式。RNA-Seq，即RNA 測序又稱轉(zhuǎn)錄組測序，是最近發(fā)展起來的利用深度測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)3，該技術(shù)能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，在分析轉(zhuǎn)錄本

9、的結(jié)構(gòu)和表達水平的同時，還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，精確地識別可變剪切位點以及cSNP(編碼序列單核苷酸多態(tài)性)，提供更為全面的轉(zhuǎn)錄組信息。相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，RNA-Seq無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針，即可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強大工具，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、臨床研究和藥物研發(fā)等。本文在扼要介紹支持RNA-Seq的新一代測序平臺的基礎(chǔ)上，對RNA-Seq原理、特點以及到目前為止在研究真核生物轉(zhuǎn)錄特征方面的進展做一個較為全面的綜述，并對其中有待進一步研究的問題進行了展望。1

10、、轉(zhuǎn)錄組測序基本原理及平臺4隨著后基因組時代的到來，轉(zhuǎn)錄組測序成為率先發(fā)展且應(yīng)用相對廣泛的技術(shù) 5。最早廣泛應(yīng)用測序技術(shù)為 70 年代的 Sanger 法，這也是完成人類基因組計劃的基礎(chǔ)，因其測序通量低、費時費力，科學(xué)家們一直在尋求通量更高、速度更快、價格更便宜、自動化程度更高的測序技術(shù)。自 2005 年以來，以Roche 公司的 454 技術(shù)、Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)以及 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的高通量測序技術(shù)相繼誕生 6。相較于傳統(tǒng)方法，該技術(shù)主要特點是測序通量高、測序時間和成本顯著下降，可以一次對幾十萬到幾百萬條 DNA 分子序列測定，這使某物種全基因

11、組和轉(zhuǎn)錄組的全貌細致分析成為可能，又稱為深度測序，很多文獻中稱其為新一代測序技術(shù)，足見其劃時代意義 7。利用深度測序技術(shù)進行對某物種轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)即 RNA 測序(RNA-Seq)，該項技術(shù)能夠在單核苷酸水平對任意生物種的整體轉(zhuǎn)錄進程檢測，不僅可以分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達水平，還能夠發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，準(zhǔn)確地識別可變剪切位點以及 cSNP(編碼序列單核苷酸多態(tài)性)，使得到的轉(zhuǎn)錄組信息更為全面，便于進一步注釋分類 8。與基因芯片相比，RNA-Seq 無需預(yù)先設(shè)計探針即可對特定條件下任意物種生長發(fā)育階段整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號、更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，因而其

12、成為目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜變化活動的強大且頗具優(yōu)越性的技術(shù)手段。一般來說，上述所有的高通量測序技術(shù)都能進行轉(zhuǎn)錄組測序，但不同平臺和機型的測序方法及效果差異決定了各種高通量測序儀具有不同的應(yīng)用側(cè)重(表 1)，這就要求在熟悉各種高通量測序儀內(nèi)在技術(shù)特點的基礎(chǔ)上進行選擇應(yīng)用；另一方面，也可嘗試結(jié)合其他生物技術(shù)以獲得更好的數(shù)據(jù)覆蓋度和更為廉價的成本9。表1 幾種主要測序平臺的比較102、目前研究轉(zhuǎn)錄組的方法主要有(l)基于雜交技術(shù),如CDNA芯片和寡聚核昔酸芯片；(2)基于測序技術(shù),如早先基于Sange:測序的SAGE(SerialAnalysisofGeneExpression)和MpSS(Mass

13、ivelypara-llelSignaturesequeneing)。全長DNA文庫和EST文庫的測序分析?，F(xiàn)在對CDNA、EST等的測序工作已升級為第二代測序技術(shù)新一代測序技術(shù)較sange測序技術(shù)通量更高、運行時間更短、測序片段更長現(xiàn)在通常將基于第二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序分析稱為RNA-Seq。2.1、種主要的轉(zhuǎn)錄組研究方法的比較見表2，其中RNA一Seq具有以下優(yōu)勢：(l)通量高，運用第二代測序平臺可得到幾個到幾百億個堿基序列，可以達到覆蓋整個基因組或轉(zhuǎn)錄組的要求；(2)靈敏度高，可以檢測細胞中少至幾個拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本；(3)分辨率高，RNA一Seq的分辨率能達到單個堿基，準(zhǔn)確度好，同時不

14、存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應(yīng)和背景噪音問題；(4)不受限制性，可以對任意物種進行全轉(zhuǎn)錄組分析，無需預(yù)先設(shè)計特異性探針，能夠直接對任何物種進行轉(zhuǎn)錄組分析。同時能夠檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并準(zhǔn)確地識別可變剪切位點及SNP、UTR區(qū)域3,4。表3是轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)與其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的比較，通過比較可以看出該技術(shù)應(yīng)用的范圍。3、RNA一Seq的主要用途11RNA一seq技術(shù)能夠在單核昔酸水平對特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測,從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息。由于轉(zhuǎn)錄組測序可以得到全部RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，加之準(zhǔn)確度又高，使得它具有十分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。主要

15、應(yīng)用于：(l)檢測新的轉(zhuǎn)錄本，包括未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本；(2)基因轉(zhuǎn)錄水平研究，如基因表達量、不同樣本間差異表達；(3)非編碼區(qū)域功能研究，如microRNA、非編碼長RNA (IncRNA)、RNA編輯；(4)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異研究，如可變剪接、基因融合；(5)開發(fā)SNPs和SSR等。表2 三種轉(zhuǎn)錄組研究方法的比較10表3 RNA-Seq與其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)比較3、RNA一Seq的主要用途11RNA一seq技術(shù)能夠在單核昔酸水平對特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測,從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息。由于轉(zhuǎn)錄組測序可以得到全部RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，加之準(zhǔn)確度又高，使得它具有十

16、分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。主要應(yīng)用于：(l)檢測新的轉(zhuǎn)錄本，包括未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本；(2)基因轉(zhuǎn)錄水平研究，如基因表達量、不同樣本間差異表達；(3)非編碼區(qū)域功能研究，如microRNA、非編碼長RNA (IncRNA)、RNA編輯；(4)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異研究，如可變剪接、基因融合；(5)開發(fā)SNPs和SSR等。4、RNA一Seq的基本步驟11提取樣本總RNA后,根據(jù)所測RNA種類進行分離純化。再進而片段化為所用測序平臺所需的長度(或反轉(zhuǎn)錄后片段化)，反轉(zhuǎn)錄后連接測序接頭。接著利用PCR擴增達到一定豐度上機測序，直到獲得足夠的序列。所得序列通過與參考基因組比對或從頭組裝(denovoassembli

17、ng)形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜。試驗流程,如圖1所示。圖1 RNA一eq試驗流程4.1、送樣要求1) 請?zhí)峁┱執(zhí)峁㎡D260/280介于1.82.2之間，濃250ng/l，總量40g的總RNA，并確保RNA無降解，無污染；或提供濃度50ng/l，總量400ng的mRNA。2) 送樣管務(wù)必標(biāo)清樣品編號，管口使用Parafilm膜密封。3) 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融。4) 送樣時使用干冰運輸。5) 質(zhì)檢以我方電泳膠圖、紫外分析儀定量為準(zhǔn)。6) 請?zhí)顚懲暾乃蜆佑唵?，并提供RNA電泳檢測照片，用自封袋密封后隨同樣品一起送樣。5、序言 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)中的應(yīng)用隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展

18、，其高通量、快速、低成本的特點成為越來越多的生物學(xué)研究者在解決生物學(xué)問題時的首選，尤其在轉(zhuǎn)錄組測序方面更顯示出極大的潛力。轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指特定生物體在某種狀態(tài)下所有基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，轉(zhuǎn)錄組研究是功能基因組研究的一項重要內(nèi)容。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能（蛋白質(zhì)組）的必然紐帶，同時相對于真核生物全基因組測序來說，轉(zhuǎn)錄組測序得到的序列不含有內(nèi)含子及其它非編碼序列，因此轉(zhuǎn)錄組測序有著無可比擬的高性價比優(yōu)勢。研究基因組結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及遺傳語言的根本規(guī)律，更需要對測序所得的海量數(shù)據(jù)進行精準(zhǔn)且全面的揭示和分析，于是生物信息學(xué)便成為一門迅速興起的交叉學(xué)科，它位于生物、計算機、

19、數(shù)學(xué)等多個領(lǐng)域的交叉點上，不斷深入去探索堿基序列數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義。目前轉(zhuǎn)錄組測序及分析技術(shù)可以解決新基因的深度發(fā)掘、低豐度轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)錄圖譜繪制、可變剪接的調(diào)控、代謝途徑確定、基因家族鑒定及進化分析等各方面的問題。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等許多領(lǐng)域。5.1、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用快速獲得您感興趣的細胞、組織或生物體內(nèi)的mRNA種類及其豐度，幫助您發(fā)現(xiàn)由于可變剪接或者可變多聚腺苷化位點選擇所產(chǎn)生的新mRNA isoforms；快速獲得您感興趣的不同細胞或者不同組織內(nèi)的mRNA種類及其豐度，分析mRNA的差異表達信息。通過差異表達

20、基因功能分析，可以發(fā)現(xiàn)在細胞分化，特別是胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞分化，機體發(fā)育，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程中基因表達調(diào)控改變的整體特征；如果您希望研究某種基因如何通過改變細胞的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮其生物學(xué)功能，您可以對該基因進行突變、敲除或敲低，然后對照組和實驗組的細胞內(nèi)的RNA-seq分析，通過差異表達分析即可以快速全面獲得您需要的信息。5.1.1、哺乳動物組織的轉(zhuǎn)錄組分析12哺乳動物基因組的巨大性和復(fù)雜性給其轉(zhuǎn)錄組研究帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。Mortazavi等研究員結(jié)合Illumina測序平臺，對成年小鼠的腦、肺、骨骼肌組織RNA進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序及分析，獲得1.4億數(shù)據(jù)，約90%的位置與已知外顯子相

21、匹配，同時也發(fā)現(xiàn)了未見報道的序列信息。約3000個新鑒定的3UTR，可能在microRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平調(diào)控中起重要作用；約3000個新鑒定的5外顯子，提示有新的啟動子序列被利用。尤其在RNA剪接方面，該研究利用高通量測序獲得的海量數(shù)據(jù)，對比到約2×105種可能剪接方式的數(shù)據(jù)庫，鑒定出1.45×105種不同的剪接方式，其中可變剪接占主導(dǎo)，3500個基因擁有至少一種內(nèi)部剪接方式。該研究成果表明：高通量測序技術(shù)不僅能夠檢測到低豐度轉(zhuǎn)錄本，而且可以發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本，精確識別可變剪接位點，提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息，這些均是芯片雜交技術(shù)或SAGE文庫測序技術(shù)無法比擬的，是目前深

22、入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的有力工具。5.2、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在癌變和其他復(fù)雜疾病發(fā)生和發(fā)展過程中，細胞內(nèi)的基因表達模式會發(fā)生顯著改變。如果您是臨床醫(yī)生或者從事相關(guān)研究的科學(xué)家，希望快速全面掌握您感興趣的癌癥或者其他疾病發(fā)生中基因表達模式的改變，對該疾病的診斷和治療提供重要解決策略；那么，RNA-seq可以通過對照正常樣本和疾病樣本中表達模式發(fā)生顯著變化的基因，及其功能分析快速為您提供正確答案。在細菌和病毒侵染時，細胞內(nèi)的基因表達模式也會發(fā)生顯著變化。這些變化對機體的抗感染功能至關(guān)重要。如果您是從事相關(guān)研究的醫(yī)生或者科學(xué)家，希望快速全面掌握在某病毒或者細菌侵染過程中細胞基因表達模式的改變特征，

23、為有效抵抗病原侵染提供重要解決策略；那么RNA-seq可以通過對照正常樣本和侵染樣本中表達模式發(fā)生顯著變化的基因，及其功能分析為您提供正確答案。5.2.1、癌細胞和組織中的基因融合132009年美國密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Christopher A. Maher等研究者采用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)對癌細胞進行測序分析，以期找到新的基因融合。該研究成功“重新發(fā)現(xiàn)”了慢性粒細胞白血病細胞中BCR-ABL1 10的基因融合、前列腺癌細胞和前列腺癌組織中TMPRSS2-ERG2基因融合。另外，研究者還驗證了在癌細胞和腫瘤組織中導(dǎo)致嵌合轉(zhuǎn)錄的新的基因融合（SLC45A3-ELK4）。表征癌細胞中特定基因組失常在確

24、定癌癥的治療目標(biāo)中有重要的作用，因此確定誘發(fā)癌癥的基因失常是癌癥研究的一個主要手段。由癌細胞中染色體重新排列而導(dǎo)致的基因融合被認(rèn)為是一些最普遍的“癌癥基因”產(chǎn)生的主要原因。由于它們在致癌過程中的誘發(fā)作用和精確地癌細胞局限性，融合基因可以描繪出理想的診斷標(biāo)記物和合理的治療目標(biāo)物。周期性基因融合，與血液惡性腫瘤、罕見骨腫瘤及軟組織腫瘤密切相關(guān)，并且最近還發(fā)現(xiàn)了其在一些常見的實體瘤中的作用，如：前列腺癌和肺癌。Christopher A. Maher等人通過對不同細胞系進行轉(zhuǎn)錄組測序及后續(xù)的qRT-PCR、FISH、Array CGH或高密度SNP Array的驗證，證實了轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ跈z測基因融合

25、是一個非常有效地工具。另外，在Christopher A. Maher等人用Illumina GenomeAnalyzer進行轉(zhuǎn)錄組測序的研究中，為了消除假陽性數(shù)據(jù)，克服缺少長讀子的深度及減少局部基因定位排列中的短讀子的難度，長讀子和短讀子的序列數(shù)據(jù)被并入到一起進行分析。結(jié)果證明，這種整體化的處理方法極有效地減少了假候選基因并大大增加了試驗可行的候選基因的比率。一個重要的局限性則是，當(dāng)鄰側(cè)的兩個基因只引起調(diào)控序列的融合而不是轉(zhuǎn)錄序列的時候，則不能使用轉(zhuǎn)錄組測序這個方法。但無論如何，該研究建立了基于轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)新基因融合的可靠方法路線，為系統(tǒng)界定癌癥相關(guān)突變開辟了重要途徑。5.3、轉(zhuǎn)

26、錄組技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用在植物的正常生長，抗旱、抗逆、以及優(yōu)良品系培育等過程中細胞的基因表達模式會發(fā)生顯著變化。如果您是從事農(nóng)業(yè)研究的科學(xué)家或農(nóng)學(xué)家，RNA-seq可以通過對照正常樣本和您感興趣樣本中表達模式發(fā)生顯著差異的基因讓您快速全面掌握在您感興趣的植物性狀中起重要功能的基因，給力您育種或者相關(guān)農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究的進程。5.3.1、擬南芥可變剪接研究14SergeiA.Filichkin等研究者采用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)對擬南芥進行可變剪接分析，發(fā)現(xiàn)42%以上具有內(nèi)含子的基因具備可變剪接形式，這個數(shù)據(jù)遠遠高于EST測序方法（20%-30%）?？勺兗艚愚D(zhuǎn)錄本多數(shù)具有提前終止密碼子（PTC+），PTC+

27、可作為無義介導(dǎo)的mRNA降解監(jiān)控機制（NMD）的靶標(biāo)，或通過調(diào)控非預(yù)期剪接和轉(zhuǎn)錄機制（RUST）來調(diào)控功能轉(zhuǎn)錄本水平。該研究還發(fā)現(xiàn)在不同環(huán)境因素脅迫下，PTC+及相關(guān)剪接變體的相對比率會隨之發(fā)生轉(zhuǎn)變。研究成果還提示，和動物體內(nèi)類似，NMD和RUST同樣在植物體內(nèi)的基因表達中廣泛存在并扮演非常重要的角色。6、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)和展望前景隨著測序技術(shù)的不斷進步，我們能夠?qū)D(zhuǎn)錄組開展更為深入的測序工作，能夠發(fā)現(xiàn)更多、更可靠的轉(zhuǎn)錄子，目前的大規(guī)模并行測序技術(shù)已經(jīng)徹底改變了我們對轉(zhuǎn)錄組的研究方法，測序結(jié)果的質(zhì)量也在不斷提高，得到的信息量也在爆炸式增長。然而和其他所有新生技術(shù)一樣，RNA-Seq技術(shù)

28、也面臨著一系列新問題：其一是龐大的數(shù)據(jù)量所帶來的信息學(xué)難題，比如如何最好地詮釋和比對鑒定多個類似的同源基因，如何確定最佳測序量，獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄圖譜等15；其二是如何針對更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組來識別和追蹤所有基因中罕見RNA 亞型的表達變化。有可能提前實現(xiàn)這一目標(biāo)的將是使用配對末端測序和單分子測序等更新的測序技術(shù)，以及使用更長的讀段來增加測序深度和覆蓋度16；其三，目前的高通量測序技術(shù)大都需要較多的樣品起始量，這使得來源極為有限的生物樣品分析受到限制，因此如何對單細胞或少量細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序是一個亟待解決的問題。最近這方面的研究也取得了一定進展，如Tang等17建立了一種mRNA-Seq 方案，它以P

29、CR為基礎(chǔ)擴增單個細胞的mRNA 轉(zhuǎn)錄組，成功分析了取自小鼠四細胞胚胎時期的單個卵裂球的轉(zhuǎn)錄組。然而該方法只能捕捉帶有poly(A)尾巴的mRNA，也不能檢測絕大多數(shù)較長的mRNA(大于3 kb)的5末端, 同時也不能保留原轉(zhuǎn)錄子的方向信息。除此之外還有一些新的針對低數(shù)量細胞進行轉(zhuǎn)錄組研究的技術(shù)正在不斷被開發(fā)18。最后，標(biāo)準(zhǔn)的RNA-Seq技術(shù)不能提供序列轉(zhuǎn)錄的方向信息，而這對于轉(zhuǎn)錄組注釋尤為重要，采用single-strand sequencing19和strandspecificsequencing20技術(shù)能很好的解決這一問題,或?qū)⒊蔀镽NA-Seq 技術(shù)發(fā)展的一個重要方向。雖然RNA-S

30、eq技術(shù)還面臨著種種困難，但作為一個剛剛起步的新技術(shù)RNA-Seq已經(jīng)顯示出其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢：既能提供單堿基分辨率的轉(zhuǎn)錄組注釋又能提供全基因組范圍的“數(shù)字化”的基因表達譜， 而且其成本通常比芯片和大規(guī)模的Sanger EST測序要低,有人甚至提出了RNA-Seq 最終取代基因芯片的猜測。然而就目前來看，作為兩個高通量的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)，在應(yīng)用的某些方面既存在重疊和競爭也存在優(yōu)勢互補，一種技術(shù)能彌補另一種技術(shù)遺漏的部分, 通常對一個生物學(xué)問題的回答需要不同實驗技術(shù)的協(xié)同配合，例如序列捕獲(Sequence Capture)技術(shù)就是結(jié)合了芯片和深度測序，利用芯片探針捕獲待測片段，再用

31、深度測序技術(shù)分析核酸序列。但基因芯片的缺點，就在于它是一個“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)；而RNA-Seq的強項，就在于它是一個“開放系統(tǒng)”，它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)，相信隨著相關(guān)學(xué)科的進一步發(fā)展和測序成本的進一步降低，RNA-Seq必將在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域占主導(dǎo)地位。參考文獻：1 Lockhart DJ, Winzeler EA. Genomics, gene expressionand DNA arrays. Nature, 2000, 405(6788): 827836.2 Costa V, Angelini C, De Feis I

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