藥物靶向調(diào)控ID4基因表達的生物信息學預測與分析

1、藥物靶向調(diào)控ID4基因表達的生物信息學預測與分析 作者：盧學春，遲小華，樓方定，朱宏麗，范輝，李素霞，于力【摘要】 ID4基因低表達與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，其高表達具有明確的抗白血病作用，但在白血病細胞無表達。本研究初步通過生物信息學方法分析ID4基因啟動子的結(jié)構(gòu)，預測調(diào)控ID4基因表達的順式元件及相關(guān)藥物，為篩選有靶向調(diào)控ID4基因表達的藥物創(chuàng)造前提。以人類基因組數(shù)據(jù)庫和計算機互聯(lián)網(wǎng)為平臺，釣取ID4基因5側(cè)翼區(qū)3 000 bp非編碼DNA序列和mRNA序列中的ORF序列；利用TESS和Genomax等在線啟動子分析軟件在人類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中搜索可能存在的順式結(jié)構(gòu)；利用SAGE和GEO數(shù)據(jù)庫對影

2、響ID4基因表達的相關(guān)因素進行分析。結(jié)果表明： ID4基因具有II型啟動子，在5'-非翻譯區(qū)的-45 bp處有1個典型的TATA盒。在長度為1 300 bp的ID4啟動子區(qū)，存在多個順式結(jié)構(gòu)，其中包括Sp1、cMyb、abaA、C/EBPalpha、GR、ERE和Zeste可能具有正向調(diào)控作用；CCAATbinding factor、GCF、WT1 KTS、HiNFC和EGR2可能具有負向調(diào)控作用。結(jié)論： ID4基因的表達可能受糖皮質(zhì)激素、雌激素、甲狀腺素和卵泡刺激素等多種活性物質(zhì)的調(diào)控。 1 / 17【關(guān)鍵詞】 ID4基因 白血病 地塞米松 雌激素卵泡刺激素 生物信息學分析Bioin

3、formatics Scan Analysis for Predicting Drug Targeted Modulation on ID4 Gene Expression Abstract Low expression of ID4 gene is tightly related with carcinogenesis and high expression shows a definite antileukemia effect, though little expression in some leukemia cells. The main purpose of this prelim

4、inary work was to analyze the construction of ID4 gene promoter and to predict the cis elements in the ID4 promoter region by scanning the drug candidate with bioinformatics method. All these work are the primary part for finding effective drugs in the treatment of leukemia via the way of ID4 expres

5、sion regulation. According to the data in GenBank and Internet platform, the 5'untranslated sequence just upstream of ID4 ORF was virtually cloned. TESS, Genomatix and GenBank databank were used to analyze the cis elements in this area. RSA was used to find the distribution patterns for all thes

6、e possible elements. SAGE and GEO datasets were used to find active substances which have the effect on the ID4 expression. The rsults indicated that ID4 had a type II promoter with a typical TATA box45 bp upstream the transcriptional original site. There were a lot of various cis elements in the 5&

7、#39;untranslated region upstream, including both positive element candidates such as Sp1, cMyb, abaA, GR, ER, Zeste and C/EBPalpha and negative element candidates such as CCAATbinding factor, GCF, WT1 KTS, HiNFC and EGR2. It is concluded that estrogen, dexamethasone, thyroid hormone and follicle sti

8、mulating hormone may participate in the regulation of ID4 gene expression in both positive and negative manners. Key words ID4 gene； leukemia; dexamethasone； Estrogen； follicle stimulating hormone； bioinformatics J Exp Hematol 2007; 15(3):594-598 ID4基因?qū)儆诼菪h(huán)螺旋（HLH）蛋白家族，對多種轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合起抑制作用1。我國于力教授2通過基

9、因組甲基化掃描技術(shù)（RLGS）發(fā)現(xiàn)ID4基因在急性白血病細胞中的表達低下，而在正常人的骨髓中具有很高的表達水平。將ID4基因轉(zhuǎn)染入急性白血病細胞系后發(fā)現(xiàn)，白血病細胞在過表達ID4時，會出現(xiàn)生長受抑，凋亡增加以及成瘤作用減弱等現(xiàn)象， ID4基因具有抗白血病作用，是一個白血病抑制基因。由于該基因具有明顯的抗白血病作用，因此如何誘導ID4基因在白血病細胞中恢復表達，并發(fā)揮其在體內(nèi)的抗腫瘤的作用，有可能成為治療白血病的一個新途徑。作為進一步研究工作的基礎(chǔ)，本研究初步利用互聯(lián)網(wǎng)平臺，對ID4基因mRNA和理論蛋白在正常組織和腫瘤細胞中的分布進行分析，為最終研究ID4基因的表達調(diào)控機制提供前提。 數(shù)據(jù)來源

10、 本研究所有數(shù)據(jù)均來源于互聯(lián)網(wǎng)開放的免費數(shù)據(jù)庫，其中包括： Gene expression omnibus (GEO) 、基因芯片表達數(shù)據(jù)庫Affymetrix (Hu35KsubB、Hu35KsubD、HGU95A、HGU133A、HGU133B、 HGU95Av2、HuGeneFL、HGFocus、HGU133 Plus)、Clontech（Atlas Human Toxicology 1.2 Array、Atlas Plastic Human 8K Microarray、Atlas Glass Human 3.8 I Microarray和MWG Human 30k Array；人類基因

11、組數(shù)據(jù)庫（GeneBank）；基因表達數(shù)據(jù)庫SAGE、GeneCard、InterPro、ProtoNet、UniProt和BLOCKS。 分析方法 通過計算機互聯(lián)網(wǎng)平臺，在人類基因組數(shù)據(jù)庫中釣取ID4基因5'非翻譯區(qū)3 000 bp的DNA序列和mRNA序列中的蛋白編碼（ORF）序列，將此序列或GenBank序號調(diào)入上述在線數(shù)據(jù)庫中進行表達信息搜索，具體參數(shù)采用數(shù)據(jù)庫通用值。 文獻收集 以"ID4 protein, human"為主題詞在PubMed數(shù)據(jù)庫中自1964年以來關(guān)于ID4研究公開發(fā)表的所有文獻。以ID4為關(guān)鍵詞在中文CMCC(19942005.09)和

12、Cbmdisc(19782005.09) 中檢索所有公開發(fā)表的文獻。 結(jié) 果 ID4基因5側(cè)翼非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)特點 ID4基因的5側(cè)翼區(qū)非編碼序列為1個典型的II型啟動子結(jié)構(gòu)，具有2個非常顯著的上游元件TATA box和GC box，其中TATA box位于-45 bp處，序列為TATAAAA；在這一區(qū)域上還分布著6個GC box，均位于TATA box上游，序列為CCCGCC，此外還有多個CpG島結(jié)構(gòu)；ID4基因的起始序列為5AGGCGCGGTTGT3，不具有典型的起始子結(jié)構(gòu)（圖1）。 ID4基因啟動子活性分析 將不同長度的ID4基因5側(cè)翼非編碼區(qū)DNA序列與熒光素酶報告質(zhì)粒相連后檢測不同片段的

13、啟動子活性1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ID4基因啟動子區(qū)在-269至+10是ID4基因的核心啟動子區(qū)，是ID4基因啟動轉(zhuǎn)錄所必需的序列（圖1）。 ID4基因啟動子活性區(qū)域存在的順式元件 根據(jù)于力等對啟動子活性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在-454至-269區(qū)域可能存在增加啟動子活性的增強子結(jié)構(gòu);在+10和+276之間可能存在具有抑制活性的下游調(diào)控元件；在+10至+276 bp被截取以后，即當5側(cè)翼非編碼區(qū)DNA序列由-454至+276共730 bp變成-454至+10共464 bp以后啟動子活性明顯增強，這說明在+10至+276之間存在抑制ID4表達的調(diào)控元件。對上述區(qū)域進行順式結(jié)構(gòu)分析后篩選處相應的調(diào)控元件（表1）。

14、ID4基因調(diào)控的基因芯片表達數(shù)據(jù)庫分析 在GEO數(shù)據(jù)庫中，其中有988個子數(shù)據(jù)有關(guān)于ID4基因表達的數(shù)據(jù)，其中對調(diào)控ID4基因有意義的子數(shù)據(jù)庫有10個（/geo/）。C57BL/6小鼠切除卵巢后注射雌二醇或其同系物3，結(jié)果胸腺ID4基因的表達有增加（圖3A）。切除子宮的小鼠在注射孕激素后ID4的表達明顯受到抑制4（圖3B）。在氧化損傷敏感Nrf2基因敲除的小鼠，純氧作用24小時后ID4的表達消失（圖4A）；REtsAFBcl2細胞在p53基因抑制劑ZVAD作用下，ID4的表達受到抑制（圖4B）；在患有嚴重自身免疫疾病的B10BL小鼠，200

15、ng的1，25Table 1. Candidate cis elements on the 5upstream region of ID4 gene 二羥維生素D3對ID4基因的表達具有抑制作用（圖4C）；辛德畢斯病毒敏感的WT293細胞ID4基因表達明顯高于對該病毒不敏感的克隆（圖4D）。另一方面，地塞米松（DEX）、全反式維甲酸（ATRA）、大劑量膽堿酯酶（ACHE）和炎性物質(zhì)白三烯（LTD4）、干擾素（IFN）和干擾素（IFN）對ID4基因的表達具有正向調(diào)控作用（圖5A、B、C、D）。 調(diào)控ID4基因表達活性物質(zhì)的文獻檢索 以ID4為主題詞，在PubMed英文數(shù)據(jù)庫和CMCC中檢索公開發(fā)

16、表的論文，一共檢索到67篇英文文獻和1篇中文文獻，其中關(guān)于ID4基因表達調(diào)控的文獻有7篇（表2），中文數(shù)據(jù)庫中未檢索出有關(guān)ID4表達調(diào)控的文獻。 討 論 目前研究者們采用RLGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了很多抑癌基因，ID4基因就是這樣一個具有抗白血病作用的基因。通過靶向誘導抑癌基因的表達來治療腫瘤，有可能成為腫瘤治療的一個新途徑，對白血病的治療更是如此。本研究以ID4基因為例，嘗試通過生物信息學的方法初步篩選具有誘導ID4基因表達作用的藥物，為進一步研究通過調(diào)控ID4基因的表達發(fā)揮抗白血病作用提供理論依據(jù)。 在研究LRP16基因表達調(diào)控的工作中，我們成功利用生物信息學方法預測了該基因的表達調(diào)控機制10，并通

17、過實驗室工作進行了證實11。從上述工作中我們體會，啟動子序列分析是尋找調(diào)控ID4基因表達的第一步，以于力對ID4基因啟動子活性的分析為基礎(chǔ)，從不同活性區(qū)域的順式作用元件分布篩選出了可能具有調(diào)控ID4基因表達的活性物質(zhì)，包括糖皮質(zhì)激素和雌激素等。為了在mRNA表達水平對上述的結(jié)構(gòu)分析進行驗證，采用SAGE和GEO數(shù)據(jù)庫對影響ID4基因表達的活性物質(zhì)進行了進一步分析，結(jié)果不但證實了地塞米松和雌激素對ID4基因的表達可能具有正向調(diào)控作用，還進一步發(fā)現(xiàn)了其他有促進ID4基因表達的活性物質(zhì)，包括全反式維甲酸和炎性物質(zhì)白三烯（LTD4）、干擾素和干擾素。此外，從數(shù)據(jù)庫的分析還發(fā)現(xiàn)，p53基因表達抑制劑ZV

18、AD和1，25二羥維生素D3對ID4基因的表達具有抑制作用。 對ID4基因表達調(diào)控分析的最后一步就是文獻復習。在7篇有關(guān)ID4基因表達調(diào)控的文獻中，一共提及了地塞米松、cAMP、FSH和甲基化等幾種因素和條件對ID4基因表達的影響。這一方面證實了數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果的準確性，另一方面也說明了僅依靠文獻了解靶基因表達調(diào)控信息的局限性。因此，采用生物信息學的綜合分析方法是進一步研究靶基因表達調(diào)控的基礎(chǔ)，是一種方便快捷的途徑。 總之，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，ID4基因的表達存在正向和負向調(diào)控兩種作用，其中正向調(diào)控因素或物質(zhì)包括：地塞米松、cAMP、全反式維甲酸、炎性物質(zhì)白三烯（LTD4）、干擾素和干擾素，

19、負向調(diào)控表達的因素或物質(zhì)包括：甲基化、ZVAD和1，25二羥維生素D3?！緟⒖嘉墨I】 1van Cruchten I，Cinato E，F(xiàn)ox M， et al. Structure, chromosomal localization and expression of the murine dominant negative helixloophelix Id4 gene. Biochim Biophys Acta, 1998; 1443: 55-642Yu L, Liu C, Vandeusen J, et al. Global assessment of promoter methyla

20、tion in a mouse model of cancer identifies ID4 as a putative tumorsuppressor gene in human leukemia. Nat Genet, 2005; 37: 265-2743Selvaraj V, Bunick D, FinniganBunick C, et al. Gene expression profiling of 17 betaestradiol and genistein effects on mouse thymus. Toxicol Sci, 2005; 87: 97-1124Umetani

21、N, Mori T, Koyanagi K, et al. Aberrant hypermethylation of ID4 gene promoter region increases risk of lymph node metastasis in T1 breast cancer. Oncogene, 2005; 24: 4721-47275Chan AS, Tsui WY, Chen X, et al. Downregulation of ID4 by promoter hypermethylation in gastric adenocarcinoma. Oncogene, 2003

22、; 22: 6946-69536Semov A, Marcotte R, Semova N, et al. Microarray analysis of Ebox bindingrelated gene expression in young and replicatively senescent human fibroblasts. Anal Biochem, 2002; 302: 38-517Chaudhary J, Johnson J, Kim G, et al. Hormonal regulation and differential actions of the helixloophelix transcriptional inhibitors of differentiation (Id1, Id2, Id3, and Id4) in Sertoli cells. Endocrinology, 2001;