廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測(cè)巢式聚合酶鏈反應(yīng)》編寫(xiě)說(shuō)明

1、廣西地方標(biāo)準(zhǔn)牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測(cè)巢式聚合酶鏈反應(yīng)法（征求意見(jiàn)稿）編制說(shuō)明一、項(xiàng)目目的意義（項(xiàng)目背景）、項(xiàng)目來(lái)源、工作概況1、項(xiàng)目背景廣西養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展十分迅速，擁有占全國(guó)第5 位的牛存欄量，但在牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）的防治方面十分薄弱。IBRV 主要引起牛高熱、鼻炎、呼吸困難和母畜流產(chǎn)等疾病，自2008 年以來(lái)，廣西多個(gè)牛場(chǎng)相繼反復(fù)暴發(fā)此病，無(wú)法根除，給廣西給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)極大的危害。目前國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有關(guān)于IBRV 巢式 PCR診斷技術(shù)規(guī)范。巢式PCR是一種新型的核酸檢測(cè)技術(shù)， 其靈敏度又比普通PCR高 100-

2、10000 倍，且操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)、成本低，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病的診斷中。廣西獸醫(yī)研究所多年來(lái)研究牛傳染性鼻氣管炎病毒，并建立了巢式 PCR檢測(cè)方法，其特異性強(qiáng)、敏感性高。既可以對(duì)分離培養(yǎng)物的IBRV DNA 進(jìn)行檢測(cè) ,也可以對(duì)直接從臨床樣品中取樣抽提的IBRVDNA進(jìn)行檢測(cè)，而且整個(gè)操作過(guò)程不超過(guò)8 小時(shí)。為了使這一先進(jìn)的病原檢測(cè)技術(shù)能更好地為生產(chǎn)服務(wù)，特制定本技術(shù)操作標(biāo)準(zhǔn)。 內(nèi)容涵蓋應(yīng)用巢式 PCR檢測(cè) IBRV的材料準(zhǔn)備、操作方法及結(jié)果判定，建立牛 IBRV的快速、特異、靈敏的檢測(cè)技術(shù)地方標(biāo)準(zhǔn)，為牛 IBRV的綜合防控體系提供診斷技術(shù)支撐，這對(duì)搞好我區(qū)牛 IBRV 的綜合防控體系建

3、設(shè)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。2. 項(xiàng)目來(lái)源1根據(jù)廣西壯族自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)2018 年第二批廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目計(jì)劃的通知（桂市監(jiān)函 2018 253 號(hào)）精神，由廣西獸醫(yī)研究所承擔(dān)牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測(cè)巢式聚合酶鏈反應(yīng)法廣西地方標(biāo)準(zhǔn)于2018 年 12 月獲得立項(xiàng)（編號(hào)2018-0271），本標(biāo)準(zhǔn)由廣西畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出，廣西獸醫(yī)研究所負(fù)責(zé)起草。3. 工作概況本標(biāo)準(zhǔn)起草團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事牛傳染性鼻氣管炎病毒相關(guān)技術(shù)的研究，先后建立了多種IBRV 的診斷技術(shù)，發(fā)表論文5 篇，其中 SCI 論文 2 篇，并將這些技術(shù)在臨床診斷上進(jìn)行應(yīng)用。 上述技術(shù)支持確保能完成本標(biāo)準(zhǔn)起草制定任務(wù)。201

4、8 年初本標(biāo)準(zhǔn)起草團(tuán)隊(duì)起草制訂牛傳染性鼻氣管炎病毒廣西地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目建議書(shū)，開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)的申報(bào)。早在 2017 年 1 月-2018 年1 月成立標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，收集資料，調(diào)查研究，編寫(xiě)制訂標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)起草小組赴南寧、柳州、來(lái)賓、北海、欽州、桂林等廣西養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展較快的地區(qū)及相關(guān)牛場(chǎng)企業(yè)進(jìn)行考察，調(diào)研和檢疫， 了解廣西 IBRV流行毒株的發(fā)病癥狀， 序列特點(diǎn)，傳播途徑等流行病學(xué)調(diào)查。并查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料， 以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法的技術(shù)要領(lǐng)， 結(jié)合我區(qū)疫情及流行毒株特點(diǎn)，分析 IBRV保守序列 gB 基因，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)及臨床驗(yàn)證后，編寫(xiě)制定IBRV 巢式 PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程征求意見(jiàn)稿。本

5、標(biāo)準(zhǔn)起草人員：范晴、張民秀、王盛、龐耀珊、劉加波。2二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則1. 政策性原則本標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)過(guò)程遵循國(guó)家相關(guān)法律、法規(guī)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。2. 先進(jìn)性原則以國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料為參考，力求反映該領(lǐng)域最新的科技成果。以國(guó)內(nèi)同類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)制訂編寫(xiě)方法為基礎(chǔ)，對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范、充實(shí)和創(chuàng)新，使之具有先進(jìn)性。3. 經(jīng)濟(jì)性原則本項(xiàng)目為自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目，因此在本標(biāo)準(zhǔn)編制過(guò)程，從獲取信息、起草、實(shí)驗(yàn)室及臨床驗(yàn)證到形成征求意見(jiàn)稿的逐一環(huán)節(jié)， 在確保質(zhì)量的前提下均力行節(jié)約，利用有限的經(jīng)費(fèi)圓滿(mǎn)完成各階段編寫(xiě)工作。4. 適用性原則本標(biāo)準(zhǔn)集國(guó)內(nèi)外 IBRV的 PCR檢測(cè)技術(shù)的成功經(jīng)驗(yàn)，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室與臨床應(yīng)用驗(yàn)證，且完全按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求編

6、寫(xiě)，內(nèi)容全面，形式規(guī)范，可操作和實(shí)用性強(qiáng)。5. 協(xié)調(diào)統(tǒng)一性原則本標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的編寫(xiě)形式和表達(dá)方法， 力求與國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。 本標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)持續(xù)查新， 確保內(nèi)容不與已有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)或相矛盾。6. 規(guī)范化原則本標(biāo)準(zhǔn)是嚴(yán)格按照GB/T 1.1 2009 的要求來(lái)編寫(xiě)的。三、標(biāo)準(zhǔn)主要主要技術(shù)內(nèi)容及依據(jù)3本標(biāo)準(zhǔn)的主要依據(jù)是參考有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合我區(qū)區(qū)情，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)及臨床驗(yàn)證后， 并參考其他資料經(jīng)室內(nèi)、 室間驗(yàn)證提出。本標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)牛輪狀病毒（ IBRV）的 gB區(qū)保守序列，設(shè)計(jì)了 2對(duì)特異性引物，優(yōu)化建立可以快速檢測(cè) IBRV的巢式 PCR，并對(duì)其特異性和敏感性進(jìn)行

7、了測(cè)定，并用臨床樣品對(duì)其可行性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，該巢式 PCR可檢測(cè)出成功地檢測(cè)出牛傳染性鼻氣管炎，而對(duì)其它牛病病原的檢測(cè)結(jié)果為陰性 , 其最低可檢測(cè)出 1pg的IBRV核酸。四、與現(xiàn)行法律、法規(guī)和有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系從事 IBRV的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，必須遵守動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法（NY/T541-2002）、病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例 （中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令第 424 號(hào)）、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理規(guī)范（農(nóng)業(yè)部 302 號(hào)公告）等相關(guān)法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于牛 IBRV的檢測(cè)和診斷，目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)行業(yè)及地方標(biāo)準(zhǔn)。 PCR方法快速、準(zhǔn)確、敏感、操作較簡(jiǎn)便，易標(biāo)準(zhǔn)化，能準(zhǔn)確快速檢測(cè)和診

8、斷牛IBRV。目前多數(shù)基層單位均裝備有PCR儀及相關(guān)設(shè)備，而且IBRV的PCR檢測(cè)操作可在一般獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室如BSL-2 實(shí)驗(yàn)室甚至 BSL-1 實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，所以易于在基層推廣應(yīng)用。綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)提供的巢式PCR檢測(cè)方法不僅與目前現(xiàn)行法律、法規(guī)和有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有沖突，而且是對(duì)現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和防治技術(shù)規(guī)范的有益補(bǔ)充。五、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的情況本標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)內(nèi)首創(chuàng)，未采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)。六、本規(guī)程的一些有關(guān)說(shuō)明4因本技術(shù)直接針對(duì)病原基因進(jìn)行檢測(cè)， 敏感性非常高， 所以在操作過(guò)程中要特別注意，避免樣品之間交叉污染而出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。另外， DNA酶在環(huán)境中無(wú)處不在，抽提好的待檢 DNA在保存過(guò)程中極易降解，會(huì)由