04-【參考】放免分析基本原理

1、2021/8/141放射免疫分析放射免疫分析臨床免疫教研室臨床免疫教研室鮑會靜鮑會靜Kris_133880558662021/8/142放射免疫分析放射免疫分析的基本原理的基本原理Content2021/8/143放射免疫分析基本原理放射免疫分析基本原理放射免疫分析概述放射免疫分析概述競爭性分析的基本原理競爭性分析的基本原理非競爭性分析的基本原理非競爭性分析的基本原理兩種分析方法的比較兩種分析方法的比較2021/8/144放射免疫分析放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），），- 簡稱放免或放免法，是一種在無須采用生物測定方法的情簡稱放免或放免法，是一種在無須采用生物測定方法

2、的情況下用于檢測抗原的實驗室測定方法，體外實驗。況下用于檢測抗原的實驗室測定方法，體外實驗。- Solomon Aaron Berson and Rosalyn Sussman Yalow - Rosalyn Sussman Yalow insulin RIA放射免疫分析概述放射免疫分析概述 RIA檢測技術(shù)可以達到檢測技術(shù)可以達到10-910-122021/8/145放射免疫分析放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），），- 廣義范圍：廣義范圍：RIA CPBA RRA IRMA- 分析原理分類：競爭性免疫分析分析原理分類：競爭性免疫分析 非競爭性免疫分析非競爭性免疫分析放射

3、免疫分析概述放射免疫分析概述2021/8/146競爭性免疫分析基本原理競爭性免疫分析基本原理-RIA- 如果標記抗原與非標記抗原對同一抗體有相同的親和力，則二者在同如果標記抗原與非標記抗原對同一抗體有相同的親和力，則二者在同一反應(yīng)系統(tǒng)中就會發(fā)生與特異抗體的競爭性結(jié)合。一反應(yīng)系統(tǒng)中就會發(fā)生與特異抗體的競爭性結(jié)合。競爭性分析的基本原理競爭性分析的基本原理 Ag + Ag* + Ab - Ag*-Ab (標記抗原-抗體復(fù)合物) Ag-Ab (非標記抗原-抗體復(fù)合物) 1 Ag和Ag* 同時存在，并均可與Ab 反應(yīng) 2 Ag*+ Ag Ab的結(jié)合位點 Ag* 或是Ag2021/8/147競爭性免疫分析

4、基本原理競爭性免疫分析基本原理-RIA競爭性分析的基本原理競爭性分析的基本原理 Ag + Ag* + Ab - Ag*-Ab (標記抗原-抗體復(fù)合物) Ag-Ab (非標記抗原-抗體復(fù)合物) 1 Ag的量與可以測量的的量與可以測量的Ag* +Ab的量形成某種函數(shù)關(guān)系的量形成某種函數(shù)關(guān)系 2 有關(guān)于有關(guān)于Ag的量的劑量曲線的量的劑量曲線 3 獲得獲得Ag的未知濃度的未知濃度2021/8/148競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線- 基于抗原抗體反應(yīng)基于抗原抗體反應(yīng)- 遵循質(zhì)量守恒原則遵循質(zhì)量守恒原則- 反應(yīng)物與產(chǎn)物之間是動態(tài)平衡關(guān)系反應(yīng)物與產(chǎn)物之間是動態(tài)平衡關(guān)系- 質(zhì)量作用定量：

5、質(zhì)量作用定量：(law of mass action)- 反應(yīng)的反應(yīng)速率與各反應(yīng)物的濃度的冪的乘積成正比，其中各反應(yīng)物的濃反應(yīng)的反應(yīng)速率與各反應(yīng)物的濃度的冪的乘積成正比，其中各反應(yīng)物的濃度的冪的指數(shù)即為元反應(yīng)方程式中該反應(yīng)物化學(xué)計量數(shù)的絕對值度的冪的指數(shù)即為元反應(yīng)方程式中該反應(yīng)物化學(xué)計量數(shù)的絕對值競爭性分析的基本原理競爭性分析的基本原理NO2+CO=CO2+NO r=kNO2CO 式中r為反應(yīng)速率，NO2、 CO分別為反應(yīng)物NO2和CO的濃度，k稱為反應(yīng)的速率常數(shù)。根據(jù)質(zhì)量作用定律，該反應(yīng)的級數(shù)與反應(yīng)的分子數(shù)是相等的。 2021/8/149競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線-

6、 Yalow and Berson 推導(dǎo)推導(dǎo)競爭性分析的基本原理競爭性分析的基本原理 k1 Ag + Ab= Ag-Ab k2 F B則： K = k1 / k2 = Ag-Ab / Ag Ab = B / FAb0一B 移項： B / F = KAb0一B F = 未結(jié)合抗原的摩爾濃度； B = 結(jié)合抗原(或抗體)的摩爾濃度 K = 平衡常數(shù)； Ab0 = 抗體位點的初始摩爾濃度 = Ab + Ag-Ab如上式，B / F與B之間應(yīng)為線性函數(shù)關(guān)系 2021/8/1410競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線- Ekins 推導(dǎo)推導(dǎo)競爭性分析的基本原理競爭性分析的基本原理 設(shè)：設(shè)

7、：p = 標記物加待測物的初始濃度；標記物加待測物的初始濃度； q = 特異性結(jié)合物的初始濃度；特異性結(jié)合物的初始濃度； B = 根據(jù)放射性測量算得的結(jié)合百分率根據(jù)放射性測量算得的結(jié)合百分率;F = 根據(jù)放射性測量算得的游離百分率根據(jù)放射性測量算得的游離百分率 R = B / F B+F=1 根據(jù)質(zhì)量作用定律： k1 Ag + Ab= Ag-Ab k22021/8/1411競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線- 抗血清的不統(tǒng)一系統(tǒng)抗血清的不統(tǒng)一系統(tǒng)- 特異性結(jié)合物或者是待測物的親和力特異性結(jié)合物或者是待測物的親和力-現(xiàn)舉人血清現(xiàn)舉人血清TSH放射免疫分析實際測定的計量反應(yīng)曲線如

8、下：放射免疫分析實際測定的計量反應(yīng)曲線如下：競爭性分析的基本原理競爭性分析的基本原理2021/8/14125.5.測量測量4.4.去上清分離去上清分離立即立即1. 1.加樣加樣1. 1.樣品或標準品樣品或標準品2.2.標記物標記物3.3.抗血清抗血清混勻混勻溫浴溫浴2.2.加分離劑加分離劑分離劑分離劑混勻混勻3.3.離心離心RIA操作流程操作流程：2021/8/1413 動態(tài)平衡體系中動態(tài)平衡體系中: *Ag與與Ag具有同樣的免疫活性和具有同樣的免疫活性和結(jié)合反應(yīng)能力結(jié)合反應(yīng)能力 *Ag和和Ab的量恒定的量恒定 Ag+*Ag的分子數(shù)大于抗體的分的分子數(shù)大于抗體的分子數(shù)子數(shù) *Ag與與Ag相互競

9、爭同相互競爭同Ab結(jié)合，彼此結(jié)合，彼此抑制，待測抑制，待測Ag與與*AgAb呈負相關(guān)函呈負相關(guān)函數(shù)關(guān)系）數(shù)關(guān)系）RIA操作流程操作流程： 7550 30 100110100 1000未標記抗原濃度（未標記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（未結(jié)合的放射活性（%）待測待測Ag與與*AgAb呈負相關(guān)函數(shù)關(guān)系呈負相關(guān)函數(shù)關(guān)系2021/8/1414 RIA競爭抑制曲線類型競爭抑制曲線類型 注：橫坐標為標準品的濃度或濃度的對數(shù)注：橫坐標為標準品的濃度或濃度的對數(shù)2021/8/1415非競爭性免疫分析基本原理非競爭性免疫分析基本原理-IRMA- 放射性核素標記在抗體上，所用的標記抗體與待測抗

10、原相比為過量。放射性核素標記在抗體上，所用的標記抗體與待測抗原相比為過量。- IRMA不存在競爭不存在競爭- 待測抗原的量與抗原待測抗原的量與抗原-標記抗體復(fù)合物的量成正相關(guān)。標記抗體復(fù)合物的量成正相關(guān)。非競爭性分析的基本原理非競爭性分析的基本原理 Ag + Ab* -Ag-Ab* + Ab* B F2021/8/1416非競爭性免疫分析基本原理非競爭性免疫分析基本原理-IRMA- 單位點單位點- 雙位點夾心法雙位點夾心法非競爭性分析的基本原理非競爭性分析的基本原理2021/8/1417非競爭性分析的基本原理非競爭性分析的基本原理固相抗體固相抗體抗原抗原多量標記的抗體多量標記的抗體抗原抗原固相

11、抗原固相抗原過量標記的抗體過量標記的抗體雙位點雙位點IRMA 單位點單位點IRMA 2021/8/1418非競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線非競爭性免疫分析劑量反應(yīng)曲線- 緩沖液中：待測物質(zhì)、過量標記抗體緩沖液中：待測物質(zhì)、過量標記抗體非競爭性分析的基本原理非競爭性分析的基本原理 Ag + Ab* -Ag-Ab* P Q PQ K = PQ / pPQ qPQ PQ2 PQp + q +1/K + pq = 0 此即 IRMA的基本數(shù)學(xué)模型 記抗原抗體復(fù)合物與待測抗原的濃度呈正相關(guān) 2021/8/1419結(jié)合率（結(jié)合率（%）Ag劑劑量量RIAIRMA和和RIA曲線形態(tài)比較曲線形態(tài)比較結(jié)合率（結(jié)合率（%）Ag劑量劑量IRMA非競爭性與競爭性分析的比較非競爭性與競爭性分析的比較2021/8/1420非競爭性與競爭性分析的比較非競爭性與競爭性分析的比較IRMA與RIA的工作原理的主要區(qū)別項目RIAIRMA