系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Fas和CD40L表達的初步研究

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Fas和CD40L表達的初步研究 作者：徐紅星, 邱德華,王慧娟 ,楊曉帆,季曉輝【摘要】 目的 探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者凋亡調(diào)節(jié)蛋白受體Fas及共刺激分子CD40L的表達情況及其相互之間的調(diào)節(jié)。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測SLE患者和正常人血清sFas和sCD40L的水平并分析兩者之間的相關(guān)性;同時分離10例SLE患者和10例正常對照的外周血淋巴細胞：將細胞培養(yǎng)48 h后，采用流式細胞儀檢測T細胞亞群表面Fas及CD40L的表達情況;在培養(yǎng)過程中分別加入抗FasL抗體阻斷Fas信號及抗CD40L抗體阻斷CD40L信號后，觀察T細胞亞群表面CD40L及

2、Fas的表達。結(jié)果 SLE患者血清sFas和sCD40L平均水平分別為4.18 g/L和5.87 g/L，顯著高于正常對照組2.27 g/L和2.31 g/L,且SLE患者血清sFas活動期高于穩(wěn)定期(P<0.01或P<0.05);sFas、sCD40L水平與SLEDAI(疾病活動指數(shù))之間存在一定的正相關(guān)性(r=0.688,r=0.253，P均<0.05),但sFas與sCD40L水平之間未顯示明顯相關(guān)(r=0.201，P>0.05)。經(jīng)細胞培養(yǎng)后，SLE患者CD4(+)和CD8(+) T細胞表面Fas表達增加，與正常對照組比較，差異有

3、顯著性(P<0.01或P<0.05);SLE患者CD4(+)和CD8(+) T細胞表面CD40L表達增加，與正常對照組比較，差異有顯著性(P均<0.05)。SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細胞上Fas與CD40L表達均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.311和r=0.517，P均<0.05)。2 / 21加入抗FasL抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細胞表面CD40L表達下降，與阻斷前比較，差異有顯著性(P<0.05);加入抗CD40L抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細胞表面Fas表達與阻斷前比較差異無顯著性

4、(P>0.05)。結(jié)論 SLE患者血清sFas和sCD40L水平升高且呈正相關(guān)關(guān)系;T細胞亞群表面Fas及CD40L高表達且呈正相關(guān)關(guān)系;T細胞上Fas的表達調(diào)控CD40L的表達。說明凋亡調(diào)節(jié)蛋白Fas及共刺激分子CD40L可能共同參與SLE的發(fā)病過程。 【關(guān)鍵詞】 系統(tǒng)性紅斑狼瘡;Fas;CD40LAbstract: Objective To investigate the expressions of Fas and CD40L in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Serum sFas, s

5、CD40L levels in patients with SLE and healthy controls were determined using a commercially available ELISA system and the correlation between the levels of sFas and sCD40L was analyzed. Meanwhile, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with SLE and health controls were isolated by gr

6、adient centrifugation of heparinized blood. The expressions of Fas and CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE and controls were determined by flow cytometry (FCM) after cultivation for 48 h. The antibodies of FasL and CD40L were add in the process of cultivation, and then the

7、expressions of CD40L and Fas of peripheral blood T lymphocytes were determined. Results The average levels of sFas and sCD40L in SLE patients were 4.18 g/L and 5.87 g/L, respectively, which were markedly higher than those of 2.27 g/L and 2.31 g/L in the healthy controls; the serum levels of sFas and

8、 sCD40L were significantly higher in active SLE patients than those inactive patients (P<0.01, P<0.05); the serum levels of sFas and sCD40L were shown to have a positive correlation with SLEDAI scores (r=0.688, r=0.253,P<0.05), while no positive correlation was revealed between

9、the levels of sFas and sCD40L (r=0.201,P>0.05). The expressions of Fas on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE were significantly higher than those of the healthy controls (P<0.01 and P<0.05); the expressions of CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patient

10、s with SLE were significantly higher than that of the healthy controls (P<0.05). There was no correlations between the expressions of Fas on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes and those of CD40L (r=0.311, r=0.517). The expressions of CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE

11、significantly decreased after blockage by the antibody of FasL (P<0.05); there was no difference in the expression of Fas in patients with SLE after blockage by the antibody of CD40L (P>0.05). Conclusion The levels of sFas and sCD40L in SLE patients were higher than those of healthy co

12、ntrols and there was a positive correlation between them. The expressions of Fas and CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE increased; and the expression of Fas had a positive correlation with that of CD40L; meanwhile, the expression of Fas regulated that of CD40L, which sugge

13、sts that both Fas and CD40L are involed in the process of SLE.Key words：systemic lupus erythematosus; Fas; CD40L系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種慢性自身免疫性疾病，引起多器官損害，具有產(chǎn)生多種自身抗體的特點1。Fas和CD40L均屬于TNF/NGF受體超家族成員。Fas是一種細胞凋亡的調(diào)節(jié)蛋白受體，通過與Fas配體結(jié)合，介導(dǎo)細胞凋亡2。CD40L是表達于B細胞或其他抗原遞呈細胞(APC)表面的CD40分子的配體，目前認(rèn)為，共刺激分子CD40-CD40L是為激活淋巴細胞的第二信號系統(tǒng)的組

14、成部分，其在T細胞介導(dǎo)的B細胞活化中具有重要作用3-4。本研究同時檢測SLE患者血清sFas和sCD40L水平及外周血CD4(+)和CD8(+) T細胞表面CD40L和Fas的表達，并用抗FasL抗體、抗CD40L抗體分別阻斷Fas信號和CD40信號測定CD4(+)和CD8(+) T細胞表面CD40L和Fas的表達，觀察了淋巴細胞表面Fas與CD40L表達的相關(guān)性及相互之間是否存在表達的調(diào)控情況，從而探討Fas和CD40L參與SLE發(fā)病過程的可能尚未被認(rèn)識的機制。1 資料和方法1.1 研究對象和分組 SLE組：南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院門診或住院的SLE患者46例，其中女性42例，男性4例，

15、年齡961歲，平均年齡32歲。其中36例進行血清sFas、sCD40L測定,10例進行T細胞亞群表面Fas與CD40L表達及相關(guān)性研究。所有SLE病例均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(ARA)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)臨床表現(xiàn)及實驗室檢查指標(biāo)，參照SLE疾病活動性指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)5評分標(biāo)準(zhǔn)，判斷SLE的病情活動性，將SLE組患者進一步分為活動期(SLEDAI 10)及緩解期(SLEDAI<10)2個亞組。正常對照組:30例，其中男3例，女27例，平均年齡32.5歲，均為門診健康體檢者。1.2

16、主要儀器 MicroReader4型酶聯(lián)免疫檢測儀,HFsafe-900型生物安全柜;TC2323型二氧化碳培養(yǎng)箱,Coulter公司流式細胞儀。1.3 主要試劑 晶美生物工程有限公司sFas檢測試劑盒,Bender MedSystems公司sCD40L檢測試劑盒,上海試劑二廠淋巴細胞分離液,GIBCO公司RPMI 1640培養(yǎng)液,eBioscience公司抗人FasL、抗人CD40L阻斷性抗體,Caltag公司PE-CY5-抗CD3、FITC-抗CD4、FITC-抗CD8熒光標(biāo)記抗體,eBioscience公司PE-抗CD40L、PE-抗Fas熒光標(biāo)記抗體。1.3 方法1.3.1 sFas、

17、sCD40L的檢測 嚴(yán)格按說明書進行操作。結(jié)果判斷：用MicroReader4酶標(biāo)儀比色，得到光密度(D)值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，D值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點，通過標(biāo)本的D值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。1.3.2 細胞分離培養(yǎng) 取正常健康體檢者和SLE患者肝素抗凝外周靜脈血，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)細胞密度至1×109/L，加入24孔培養(yǎng)板中37、5% CO2培養(yǎng)48 h。SLE患者細胞培養(yǎng)液中純化抗人FasL抗體和純化抗人CD40L抗體濃度均為1 mg/L。正常對照組細胞培養(yǎng)液中植物血凝素(PHA)濃度為75 mg/L。1.3.3

18、流式細胞儀檢測 取100 l細胞懸液，分別加入抗CD3、抗CD4、抗CD8單抗各5 l，加入抗Fas抗體或抗CD40L抗體20 l，在對照管中加入正常小鼠IgG1(獨特型)20 l，混勻后置室溫20 min，用PBS洗1次，棄上清液加入生理鹽水0.5 ml后進行流式細胞計數(shù)分析。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用±s表示，樣本均數(shù)比較采用t檢驗。相關(guān)性檢驗采用Spearman等級資料進行分析，P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。2 結(jié) 果2.1 SLE患者與正常對照組血清sFas、sCD40L檢測結(jié)果比較 SLE患者血清sFas、sCD40L水平均明顯高于正常對照組(P均&

19、lt;0.01)，SLE患者血清sFas、sCD40L水平活動期均高于緩解期(P<0.01或P<0.05)。見表1。2.2 SLE患者血清sFas、sCD40L水平與SLEDAI積分的相關(guān)性分析及sFas、sCD40L水平之間的相關(guān)性分析 sFas、sCD40L與SLEDAI積分之間均存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.688、r=0.253，P均<0.05)，sFas與sCD40L水平之間未顯示明顯相關(guān)(r=0.201，P>0.05)。表1 SLE患者和正常對照組血清sFas、sCD40L水平與正常對照組比較：*P<0.05;*P&a

20、mp;lt;0.012.3 SLE患者和正常對照組CD4(+)及CD8(+) T細胞表面Fas和CD40L表達的比較 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細胞表面表達的Fas顯著高于正常對照組(P<0.01或P<0.05);SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細胞表面表達的CD40L也高于正常對照組(P均<0.05)。見表2。表2 SLE患者和正常對照組間T細胞表面Fas、CD40L表達的比較與正常對照組比較：*P<0.05，*P<0.012.4 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細胞Fas與CD40L表達的相

21、關(guān)性比較 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細胞上Fas與CD40L表達均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.311、r=0.517,P均<0.05)。2.5 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細胞在抗人FasL抗體及抗人CD40L抗體阻斷前后CD40L及Fas表達的比較 SLE患者T細胞培養(yǎng)中加入抗FasL抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細胞表面CD40L表達與阻斷前比較均明顯下降(P<0.05);加入抗CD40L抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細胞表面Fas表達與阻斷前比較差異無顯著性(P>0.05)。見表3。表3 SLE患者CD

22、4(+)和CD8(+) T細胞在抗人CD40L抗體阻斷前后CD40L、FAS 表達的比較與阻斷前比較：*P<0.053 討 論SLE是一種至今病因未明的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。近來研究較多的是與自身免疫性疾病關(guān)系密切的T細胞表面分子Fas和CD40L，兩者在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著極其重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Fas是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的細胞表面分子，其配體是FasL，F(xiàn)as/FasL參與細胞凋亡過程;CD40L是CD40的配體，屬TNF超家族成員，主要存在于活化的CD4(+) T細胞表面，亦少量表達于CD8(+) T細胞B細胞NK細胞單核細胞及血小板表面。表達

23、于B細胞或抗原提呈細胞表面的CD40分子與其配體CD40L間的相互作用構(gòu)成了一組重要的共刺激信號6-7。研究表明，靜止的T細胞表達一定量的Fas，但對凋亡不敏感，當(dāng)抗原與T細胞受體(TCR)結(jié)合后，在靜止T細胞被激活而增殖的同時，也啟動凋亡，導(dǎo)致涉及凋亡的Fas基因轉(zhuǎn)錄增加，F(xiàn)as表達上調(diào)，SLE患者T細胞表面表達的Fas增加8。同時有研究表明，SLE患者外周血T、B細胞表面CD40L表達增加，且活化T細胞表達CD40L9。說明SLE的發(fā)生、發(fā)展與凋亡調(diào)節(jié)分子和共刺激分子的異常密切相關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示，不僅SLE患者血清sFas與sCD40L水平升高且呈正相關(guān)關(guān)系，而且，SLE患者CD4(

24、+) T細胞和CD8(+) T細胞表面的Fas表達高于正常對照組，反映了SLE患者T細胞處于異?；罨癄顟B(tài);Fas表達增加，參與誘導(dǎo)了SLE患者T細胞凋亡;SLE患者CD4(+) T細胞和CD8(+) T細胞表面CD40L的表達也升高，也反映了SLE患者T細胞的活化。已有研究證實，部分活化的T細胞在無輔助刺激信號條件下即可分泌細胞因子如IL-1、IL-1、IL-12等，這些細胞因子可作為第二信號作用于T細胞，促進T細胞的進一步活化、分化和增殖，表達較強的CD40L10。進一步分析表明，SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細胞上Fas與CD40L表達也呈正相關(guān)關(guān)系，提示Fas表達與CD40L表

25、達的密切相關(guān)性。同時，加入抗FasL抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細胞表面CD40L表達下降，與阻斷前比較，差異有顯著性(P<0.05);加入抗CD40L抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細胞表面Fas表達與阻斷前比較差異無顯著性(P>0.05)。這一結(jié)果說明，T細胞上Fas的信號可能對CD40L的表達有調(diào)控作用，但CD40/CD40L信號則未呈現(xiàn)對Fas表達的調(diào)節(jié)作用。T細胞上調(diào)CD40L表達有重要的生物學(xué)意義。在SLE的病理機制中，T細胞CD40L表達的上調(diào)，可進一步導(dǎo)致自身反應(yīng)性B細胞的活化、增殖、分化和自身抗體的產(chǎn)生。而且，盡管SLE的T

26、細胞高表達Fas，T細胞凋亡明顯，而B細胞卻凋亡并不顯著11，這可能與CD40L介導(dǎo)的信號可使活化的B細胞降低對凋亡信號的敏感性、使B細胞逃逸凋亡有關(guān)，也促進了自身抗體的產(chǎn)生12。因此，F(xiàn)as/FasL相互作用形成的Fas信號上調(diào)T細胞CD40L表達，可能是這兩個細胞信號系統(tǒng)共同參與SLE發(fā)病的機制之一。最近，Collins等13發(fā)現(xiàn)，從萊姆病關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液中分離獲得的Vdelta1 T細胞高表達FasL，可通過Fas/FasL信號途徑作用于不成熟樹突細胞(DC)表面的Fas，促進DC的活化和成熟，B細胞在自身抗體持續(xù)產(chǎn)生中是否也起類似DC的作用值得深入研究。迄今為止，尚未見到關(guān)于Fas/Fa

27、sL可上調(diào)T細胞CD40L表達的研究報告。本研究的實驗則初步提示了這種相互調(diào)節(jié)的可能。當(dāng)然，這還需要進一步的深入研究加以證實。目前SLE的發(fā)病機制尚不完全清楚，F(xiàn)as、CD40L的高表達可能是SLE發(fā)病的重要原因，研究Fas及CD40L信號的相互調(diào)節(jié)可能會為探討SLE發(fā)病機制及藥物干預(yù)提供新的線索?！緟⒖嘉墨I】 1 Kotzin BL. Systemic lupus erythematosas J.Cell, 1996,85(3):303-306.2 李華，王吉波.細胞凋亡與系統(tǒng)性紅斑狼瘡J.山東醫(yī)藥,2005,45(16)：80-81.3 李玉杰.共刺激分子CD28：CTLA4/B7及CD4

28、0/CD40L和SLE J.國外醫(yī)學(xué)·免疫學(xué)分冊,2003,26(3):116-120.4 Mehling A, Loser K, Varga G, et al. Over-expression of CD40 ligand in murine epidermis results in chronic skin inflammation and systemic autoimmunity J. J Exp Med, 2001, 194(5):615-628.5 Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, et al. Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. The Committee on Prognosis Studies in SLE J.Arthritis Rheum, 1992, 35(6):630-640.6 Yazdany J, Davis J. The role of CD40 ligand in systemic lupus erythematosus J.Lupus, 2004, 13(5):377-380.7 楊灝,賀福初,周鋼橋.CD40/CD40L軸的生物學(xué)功能及其與疾病的關(guān)系研究進展J