雷公藤內(nèi)酯醇抑制小鼠EAE與其下調(diào)脾細(xì)胞INFγ表達(dá)和上調(diào)IL10的分泌有關(guān)

1、雷公藤內(nèi)酯醇抑制小鼠EAE與其下調(diào)脾細(xì)胞INF表達(dá)和上調(diào)IL10的分泌有關(guān)作者：樊紅翠, 任曉蓉, 尉杰忠, 郭敏芳, 紀(jì)寧, 孫永勝, 梁麗云, 馬存根【摘要】 目的: 探討雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide, Tri）治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的有效性和可能機(jī)制。方法: 雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為EAE組(28只)、 Tri治療組（20只）和佐劑組（18只）。EAE組和Tri治療組用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白3555多肽（MOG3555）免疫建立EAE模型, 佐劑組以等量生理鹽水代替。Tri治療組于免疫后5 d開(kāi)始按100 g/(kg·d)腹腔注射Tri, EAE組和

2、佐劑組等量的生理鹽水作為對(duì)照。觀察3組小鼠的發(fā)病情況以及病理變化, 免疫后1820 d無(wú)菌分離脾淋巴細(xì)胞, 分2組, 分別為對(duì)照組（只加200 L的細(xì)胞懸液）、 實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞懸液中加入MOG3555每孔終濃度為10 mg/L）, 并將各組細(xì)胞懸液接種于96孔板中置于37、 50 mL/L CO2條件下孵育48 h。用MTT法檢測(cè)MOG3555刺激前后各組脾淋巴細(xì)胞的增殖情況, ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子INF、 IL17、 IL10和IL4的水平。結(jié)果: Tri能夠顯著改善EAE的發(fā)病, 減輕炎性浸潤(rùn), 并且可抑制MOG3555誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P<0.0

3、1）及INF的分泌（P<0.05）, 促進(jìn)IL10的分泌（P<0.05）, 而對(duì)IL17和IL4的分泌沒(méi)有顯著性影響。結(jié)論: Tri可以有效抑制小鼠EAE, 這種抑制可能與其對(duì)脾細(xì)胞中INF2 / 24表達(dá)的下調(diào)及對(duì)IL10分泌的上調(diào)作用密切相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 雷公藤內(nèi)酯醇; 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎; 淋巴細(xì)胞增殖; INF; IL17; IL10AbstractAIM: To explore the therapeutic effectivity and the possible mechanism of triptolide (Tri) on experime

4、ntal autoimmune encephalomyelitis (EAE). METHODS: All female C57BL/6 mice were randomly divided into EAE group (28), Tri treated group (20) and adjuvant group (18). Mice in EAE and treated groups were immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 3555 (MOG3555), adjuvant group was inje

5、cted at the same time, but instead of MOG3555 with normal saline. Tri was intraperitoneally injected in the dosage of 100 g/(kg·d) in treated group on day 5 postimmunization (p.i.), and mice in EAE and adjuvant group injected with normal saline as control. The clinical feature and pathological

6、changes were observed and the splenic lymphocytes were prepared on days 1820 p.i. The cell cultures were divided into the control group (only 200 L of cell suspension) and the experimental group (cell suspension in the presence of 10 mg/L MOG3555 ). Then all of them were inoculated in 96well flatbot

7、tom plates under 37, 50 mL/L CO2. After 48 h, the proliferation assay was determined by MTT, and the supernatants were harvested for the detection of INF, IL17, IL10 and IL4 by ELISA. RESULTS: Tri treatment showed an significantly protective action on EAE. After the intervention of Tri, the levels o

8、f IL10 were increased (P<0.05), but the secretion of INF and proliferation response of splenic lymphocytes induced by MOG3555 were statistically significantly inhibited（P<0.05 and P<0.01, respectively）. There were no influences on the amount of IL17 and IL4 by Tri. CONCLUSION: T

9、ri is an effective drug in suppressing murine EAE. This suppression is surposed to be related to downregulation of INF and upregulation of IL10 secretion in splenic lymphocytes.Keywordstriptolide; experimental autoimmune encephalomyelitis; proliferation response; interferon; interleukin17; interleuk

10、in10多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）白質(zhì)的自身免疫性脫髓鞘疾病, 具體發(fā)病機(jī)制還不清楚, 因此探討MS的免疫學(xué)機(jī)制一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是髓鞘特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病, 與MS在病理和臨床表現(xiàn)上極為相似, 是目前國(guó)際上公認(rèn)的研究MS的理想模型。EAE在整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在著Th1/Th2型細(xì)胞偏移, 并以激活的Th1型細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在效應(yīng)T細(xì)胞

11、增殖、 分化和作用過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用1。因此, 剖析效應(yīng)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子特點(diǎn)成為理解EAE發(fā)病機(jī)制的核心問(wèn)題。 雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide, Tri)是一種有效的免疫抑制劑, 臨床應(yīng)用日趨廣泛, 但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。尤其在MS和EAE發(fā)病機(jī)制的研究中報(bào)道較少。既往我們研究發(fā)現(xiàn)Tri可以通過(guò)下調(diào)IL6、TNF、MCP1、ICAM1等的表達(dá)來(lái)保護(hù)血腦屏障, 減少T淋巴細(xì)胞進(jìn)入CNS, 抑制EAE2, 3。但對(duì)經(jīng)典的Th1細(xì)胞因子INF和Th2細(xì)胞因子IL10、IL4 以及炎性細(xì)胞因子IL17的分泌有無(wú)影響, 尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)用Tri 干預(yù)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白3555多肽(m

12、yelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 3555, MOG)誘導(dǎo)的EAE, 檢測(cè)Tri對(duì)MOG誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖以及分泌細(xì)胞因子的影響, 探討Tri治療EAE可能的作用機(jī)制。1 材料和方法1.1 材料清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠, 質(zhì)量1822 g, 購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。MOG3555多肽（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNG）由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成, 純度HPLC>97%; 完全弗氏佐劑（CFA）購(gòu)自Sigma公司; 結(jié)核分枝桿菌H37Ra（TB）購(gòu)自BD公司; 百日咳毒素（PTX）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品

13、研究所。Tri(純度98 HPLC）購(gòu)自南京皮膚病研究所。小鼠源性INF、IL10、IL17、IL4的ELISA檢測(cè)抗體, 高糖DMEM培養(yǎng)液, 青霉素鏈霉素雙抗, 胎牛血清購(gòu)自Sigma公司。1.2 方法1.2.1 動(dòng)物分組及EAE模型的制備將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組, 即EAE模型組（28只）, Tri治療組（20只）和佐劑組（CFA, 18只）。EAE模型組和Tri治療組均按每只0.1 mL注射含TB的MOG抗原乳劑, 在脊柱背側(cè)后半部中線兩側(cè)分四點(diǎn)進(jìn)針皮下注入, 佐劑組以生理鹽水代替MOG多肽制成乳劑同等量同樣方法注入, 并將免疫當(dāng)天記為免疫后第0天(p.i. 0 d), 各組于

14、p.i. 0 d、 p.i. 2 d分別腹腔注射PTX（800 ng/只）作為免疫增強(qiáng)劑。Tri治療組于免疫后第5天開(kāi)始按100 g/（kg·d）腹腔注射Tri溶液直到處死, EAE模型組給予同等劑量生理鹽水。免疫后每天觀察各組小鼠行為學(xué)表現(xiàn)并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分, 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)際通用的五分制評(píng)分法: 0分, 無(wú)任何癥狀; 1分, 尾部張力消失, 可見(jiàn)輕度笨拙; 2分, 一側(cè)后下肢無(wú)力, 被動(dòng)翻身后可恢復(fù); 3分, 雙后肢癱瘓, 被動(dòng)翻身后不能恢復(fù), 但給予刺激后可挪動(dòng); 4分, 雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢癱瘓; 5分, 瀕死狀態(tài)/死亡。介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間以±0.5分記。1.2.2 病

15、理學(xué)觀察動(dòng)物于p.i.1820 d, 無(wú)菌取完脾臟的小鼠（見(jiàn)下文）, 生理鹽水心臟灌流, 4%多聚甲醛灌流固定, 解剖分離腦、 脊髓, OCT包埋, 冰凍切片, 行HE染色。1.2.3 脾細(xì)胞的分離和制備動(dòng)物于p.i.1820 d, 各組取出8只小鼠, 用100 mg/L水合氯醛按5 000 mL/kg體重腹腔注射麻醉, 750 mL/L酒精皮膚消毒后, 無(wú)菌操作取脾, 剪碎, 用一次性注射器針芯研磨, 400鉬尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾, 置于15mL離心管, 加入已消毒預(yù)冷的PBS中, 1 200 r/min離心5 min, 棄上清, 再加入PBS, 反復(fù)吹打重懸后再次離心, PBS洗3次, 棄上清,

16、按2mL/管加入已消毒預(yù)冷的雙蒸水, 重懸, 45s后按1 mL/管快速加入已消毒預(yù)冷的27g/L的NaCl, 裂解紅細(xì)胞, 并用已消毒預(yù)冷的PBS補(bǔ)充體積至10 mL左右, 1200 r/min離心5 min, 棄上清, 重懸, 細(xì)胞計(jì)數(shù), 用DMEM完全培養(yǎng)液（高糖DMEM, 50 mL/L CO2的胎牛血清, 100 U/mL青霉素鏈霉素）將各管細(xì)胞密度調(diào)整至1×109/L, 然后將其接種在96孔板中, 200 L/孔細(xì)胞懸液, 置于37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育。1.2.4 MTT法檢測(cè)脾細(xì)胞增殖48h后, 收集上清液-20凍存。剩余細(xì)胞設(shè)對(duì)照組（只加200 L的

17、細(xì)胞懸液）、 實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞懸液中加入MOG3555, 每孔終濃度為10 mg/L), 每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔, 每孔加入30 L MTT溶液（5 g/L）, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 吸干液體, 每孔加入150 L的二甲基亞砜（DMSO）, 振蕩溶解紫色結(jié)晶, 測(cè)定A490值。結(jié)果用刺激指數(shù)（SI）表示。SI=實(shí)驗(yàn)組的A490值/對(duì)照組的A490值。1.2.5 細(xì)胞因子的檢測(cè)參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中INF、 IL10、 IL17、 IL4的含量。即向96孔板中分別加入50 L的捕獲抗體, 密封后4過(guò)夜; 次日用洗滌緩沖液洗4次, 向96孔板中分別加入70 L封閉液, 室溫封閉1 h; 洗滌液洗滌4次

18、, 按50 L/孔加入待測(cè)上清液, 每板設(shè)2個(gè)空白對(duì)照孔, 各加入50L DMEM不完全培養(yǎng)液, 室溫下孵育2 h; 用洗滌緩沖液洗4次, 各孔加入50 L的相應(yīng)的檢測(cè)抗體（生物素標(biāo)記）, 室溫下孵育1 h; 洗滌緩沖液洗滌3次, 加入50 L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的卵白素, 室溫下孵育45 min; 用洗滌液清洗5次后, 加入50L 酶作用底物, 室溫孵育1520 min底物顯色后, 加入50L終止液, 測(cè)定A450值。1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用x±s來(lái)表示, 采用SPSS13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。組間比較用單因素方差分析, 率的比較采用2檢驗(yàn), P<0.05

19、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 Tri對(duì)EAE小鼠發(fā)病的影響EAE組小鼠免疫當(dāng)天死亡1只, 其余小鼠從p.i.10 d開(kāi)始相繼發(fā)病, p.i. 17d左右達(dá)到發(fā)病高峰, 平均行為學(xué)評(píng)分達(dá)（2.466±0.812）分, 體重平均下降（0.665±0.491）g, 發(fā)病率達(dá)80%, 小鼠先是表現(xiàn)為尾部肌張力低下, 后進(jìn)展為雙側(cè)后肢癱瘓, 不能自動(dòng)翻身。Tri治療組與EAE組相比較, 發(fā)病率明顯減低, 小鼠發(fā)病相對(duì)比較晚, 體重減輕的程度顯著改善, 行為學(xué)評(píng)分明顯改善（表1）。表1 各組小鼠的發(fā)病情況（略）2.2 Tri對(duì)EAE小鼠病理學(xué)改變的影響HE染色顯示EAE組小鼠炎性病灶

20、主要侵犯脊髓實(shí)質(zhì), 主要分布在脊髓腰膨大白質(zhì)區(qū), 可見(jiàn)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 腦實(shí)質(zhì)炎性浸潤(rùn)相對(duì)于脊髓比較輕, Tri治療后小鼠腦和脊髓實(shí)質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。佐劑組小鼠腦和脊髓未見(jiàn)明顯異常改變(圖1)。2.3 Tri對(duì)MOG3555多肽抗原刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 MOG3555多肽免疫小鼠后第18天, MOG3555多肽抗原刺激脾淋巴細(xì)胞增殖作用明顯（P<0.01）; Tri對(duì)MOG3555多肽抗原誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)具有明顯的抑制作用（P<0.01, 表2）。表2 MOG3555 多肽刺激48 h后對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（略）2.4 Tri對(duì)MOG

21、3555多肽刺激的脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響MOG3555多肽可明顯刺激脾淋巴細(xì)胞INF、IL10的分泌, 對(duì)IL17、 IL4的分泌沒(méi)有明顯影響, Tri則對(duì)MOG3555多肽抗原刺激脾淋巴細(xì)胞的INF分泌產(chǎn)生顯著的抑制作用, 明顯促進(jìn)IL10的分泌, 但對(duì)IL17、IL4的分泌沒(méi)有影響（圖2）。3 討論 EAE是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病, 細(xì)胞因子的生成和調(diào)節(jié)是CD4+T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)作用的主要機(jī)制。MOG是EAE模型中能引起髓鞘缺失的主要免疫靶點(diǎn), 是能誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)和自身抗體生成的自身抗原, 用其誘發(fā)的EAE模型具有MS的臨床病理特點(diǎn)。我們利用MOG多肽作為免疫原誘導(dǎo)EAE模

22、型, 并用MOG3555多肽體外刺激分離脾淋巴細(xì)胞并培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)在EAE發(fā)病高峰期, 脾淋巴細(xì)胞經(jīng)MOG刺激后仍表現(xiàn)為高度的活躍性, 細(xì)胞增殖指數(shù)較佐劑組明顯高, 檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子結(jié)果顯示INF顯著上調(diào), IL17分泌沒(méi)有明顯改變。INF是IL12（p40p35）誘導(dǎo)的Th1細(xì)胞分泌的促炎性因子, 在EAE急性期顯著上調(diào), 其在EAE發(fā)病機(jī)制中所扮演的重要角色已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)報(bào)道1, 并且抑制致腦炎Th1細(xì)胞INF的生成對(duì)EAE有一定的緩解作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在EAE中IL17與INF的促炎性作用極為相似, 但I(xiàn)L17的升高較INF要早4。IL17由IL23（p40p19）誘導(dǎo)生成的Th

23、17細(xì)胞分泌, 在EAE發(fā)病前外周淋巴細(xì)胞內(nèi)即有顯著升高, 發(fā)病高峰期外周淋巴細(xì)胞內(nèi)IL17表達(dá)不明顯, 但在CNS中可以檢測(cè)到高水平的IL17生成4。本研究顯示IL17分泌沒(méi)有明顯改變, 一方面可能是由于發(fā)病高峰期Th0細(xì)胞分化生成的Th17細(xì)胞主要轉(zhuǎn)移至CNS來(lái)發(fā)揮作用, 另一方面可能與INF的拮抗作用有關(guān)。新近有研究發(fā)現(xiàn)IL12的組成亞基p35缺失會(huì)加重EAE5。更有意思的是, INF(-/-)的EAE小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞經(jīng)MOG刺激后Th17細(xì)胞群明顯增加6, 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IL12受體IL12R2(-/-)的小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)IL17的表達(dá)顯著上調(diào)7。因?yàn)镮L23與IL12共用p40亞基, 并

24、與IL12R1受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用, 因此, 我們推測(cè)INF在EAE中能夠通過(guò)IL12/INF軸抑制IL23誘導(dǎo)的Th17的分化, 進(jìn)而抑制IL17的生成。 IL10是Th2及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌, 被認(rèn)為是一種免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子, 可以抑制Th1細(xì)胞分泌INF、IL2等因子, 在EAE中具有抑制免疫病理的作用8。Sonobe等4研究發(fā)現(xiàn)EAE發(fā)病前脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞IL10mRNA表達(dá)急劇減少, 但是在CNS中IL10mRNA表達(dá)逐漸升高, EAE發(fā)病高峰期脾臟CD4+T細(xì)胞和CNS中CD8+T細(xì)胞表達(dá)IL10mRNA急劇上調(diào), 認(rèn)為這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是依賴IL10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的。IL4能

25、夠誘導(dǎo)初始Th0向Th2分化, 并可拮抗INF的作用, 盡管IL4作為EAE的抑制因子, 但I(xiàn)L4基因敲除鼠與對(duì)照組相比有著相似的發(fā)病率和死亡率9, 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)IL4并非T細(xì)胞產(chǎn)生, 但MOG特異性CD4+細(xì)胞可能誘導(dǎo)細(xì)胞無(wú)害性旁路反應(yīng)產(chǎn)生IL4, 并且與疾病的階段和分化場(chǎng)所有關(guān)10。本研究檢測(cè)上述細(xì)胞上清液中IL10、IL4的分泌, 發(fā)現(xiàn)EAE疾病高峰期, IL10顯著上調(diào), IL4的分泌沒(méi)有明顯改變, 推測(cè)EAE高峰期即存在Th1/Th2向Th2的偏移, IL10發(fā)揮著較IL4更為顯著的作用, 其抗炎性作用為下一階段疾病的暫時(shí)緩解奠定了基礎(chǔ)。 Tri是從雷公藤中分離出來(lái)的含環(huán)氧的二萜內(nèi)酯

26、化合物, 近年來(lái)研究表明Tri有免疫調(diào)節(jié)作用以及抗炎性作用11, 但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。我們利用Tri來(lái)干預(yù)治療MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠, 結(jié)果顯示Tri可以明顯減低EAE小鼠發(fā)病率, 改善臨床癥狀, 減輕病灶的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)還進(jìn)一步證實(shí)了Tri能夠明顯抑制MOG3555多肽抗原誘導(dǎo)的EAE小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)以及INF的分泌, 提高IL10的分泌, 推測(cè)Tri可能直接抑制Th1類(lèi)細(xì)胞因子的分泌, 促進(jìn)Th2類(lèi)細(xì)胞因子的釋放, 誘導(dǎo)Th1/Th2向Th2方向偏移。但對(duì)于IL4、IL17的分泌沒(méi)有顯著性影響。這與最近的一項(xiàng)研究相矛盾, Wang等11研究發(fā)現(xiàn)Tri可以抑制EAE脾單個(gè)核細(xì)

27、胞內(nèi)IL17mRNA的表達(dá), 并與抑制核因子NFB表達(dá)有關(guān), 這可能與實(shí)驗(yàn)方法以及采集標(biāo)本時(shí)間不同有關(guān)。因此Tri在EAE復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的微觀調(diào)節(jié)作用及其具體的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探討和證實(shí), 相信Tri作為中國(guó)的傳統(tǒng)中藥, 以其資源豐富、 價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì), 有著廣闊的發(fā)展前景。致謝: 本實(shí)驗(yàn)部分內(nèi)容在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所完成, 在此對(duì)肖保國(guó)教授的悉心指導(dǎo)表示衷心地感謝！【參考文獻(xiàn)】 1McGeachy MJ, Anderton SM. Cytokines in the induction and resolution of experimental autoimmune

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