糖尿病足不同辨證分型RAGE、IGF1R基因表達(dá)

1、糖尿病足不同辨證分型RAGE、IGF-1R基因表達(dá) 作者：李曉軍， 計小清， 張庚揚【摘要】 目的檢測不同中醫(yī)辨證分型糖尿病足患者截肢標(biāo)本中RAGE、IGF-1R基因表達(dá)，以探討其在糖尿病足發(fā)病中的作用，并分析其在不同證型間的關(guān)聯(lián)性。方法選擇糖尿病足患者最為常見的氣陰兩虛瘀阻、氣血兩虛瘀阻、脈絡(luò)熱毒三種證型，以截肢的肌肉組織為標(biāo)本，并以正常截肢患者的標(biāo)本為對照，制備RNA，并逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR技術(shù)分析RAGE、IGF-1R的含量。結(jié)果3種證型間RAGE、IGF-1R的含量無統(tǒng)計學(xué)意義，但與正常對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論RAGE、IGF-1R基因表達(dá)量的改變與糖尿病足的發(fā)病有關(guān)，但

2、在截肢階段各證型間無顯著關(guān)聯(lián)性，不能作為中醫(yī)辨證分型的微觀依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】 糖尿病足; 糖基化終末產(chǎn)物受體; 胰島素樣生長因子-1受體; 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng); 基因表達(dá); 關(guān)聯(lián)性糖尿病足是糖尿病患者的重要并發(fā)癥,是糖尿病致殘、致死的重要原因，嚴(yán)重者可因合并感染引起肢端壞疽,稱為糖尿病壞疽，約有5%10%的患者需進(jìn)行截肢手術(shù)。目前對糖尿病足病理機(jī)制還不完全清楚,但目前已認(rèn)識到與體內(nèi)的高糖環(huán)境、病理產(chǎn)物的蓄積，細(xì)胞因子的缺乏或功能低下等多方面因素有關(guān)，終末糖基化產(chǎn)物受體作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體介導(dǎo)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和其配體在細(xì)胞表面結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,在糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生中起

3、重要作用。胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)與胰島素樣生長因子1(IGF-1)特異性結(jié)合后引起的信號通路不僅參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，而且還能夠抑制細(xì)胞趨向凋亡。本實驗試從分子生物學(xué)的角度，探討 (RAGE)及胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)的表達(dá)，并分析其與中醫(yī)辨證分型間的關(guān)聯(lián)性。2 / 141 材料與方法1.1 樣本來源32例均為天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2005-082006-07住院患者,其中男25例，女7例，年5187歲，平均66.7歲。糖尿病病程最長32年,最短7年,平均(19±2.7)年。1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2000年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)會第2屆

4、糖尿病足會議所制定的“糖尿病足(肢端壞疽)檢查方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)”。1.3 截肢標(biāo)準(zhǔn)參照國際糖尿病足工作組編寫的糖尿病足國際共識1中關(guān)于“大截肢的定義、標(biāo)準(zhǔn)和指標(biāo)”執(zhí)行。具體標(biāo)準(zhǔn)是：進(jìn)行性缺血性壞死中嚴(yán)重的靜息痛，因某些原因無法通過血管重建、藥物控制或小截肢來減輕的嚴(yán)重疾病狀態(tài)，或雖然沒有顯著的動脈病變，但有嚴(yán)重的進(jìn)行性糖尿病足感染，伴有或不伴有敗血癥，通過清創(chuàng)和最佳的保守治療包括使用針對感染微生物的抗生素均不能控制病情;或嚴(yán)重的神經(jīng)性骨關(guān)節(jié)病變性畸形。1.4 中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)參照中醫(yī)外科學(xué)(第7版)及中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則·脫疽之中醫(yī)辨證分型方案分為氣陰兩虛淤阻、氣血兩虛淤阻、脈絡(luò)熱

5、毒型3種常見分型。1.5 標(biāo)本取材壞疽截肢標(biāo)本24例，其中按中醫(yī)辨證分型分為氣陰兩虛瘀阻、氣血兩虛瘀阻、脈絡(luò)熱毒型各8例，另取正常創(chuàng)傷截肢標(biāo)本8例，留取腓腸肌，于液氮中保存?zhèn)溆谩?.6 設(shè)備與試劑Universal 16R 低溫高速離心機(jī)(Beckman公司);ABI Prism7000 PCR儀(ABI公司,美國); RT-PCR二步法試劑盒(寶生物工程有限公司)TRIZOL Reagent(Invitrogen公司)Tris、DEPC(美國SIGMA公司)。1.7 引物的設(shè)計與合成引物序列檢索自Primer Bank，使用計算機(jī)引物設(shè)計網(wǎng)站Primer 3和引物分析軟件OLIGO設(shè)計。引物

6、序列如下：GAPDHF: 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，GAPDHR: 5-GAAGATGGTGATGGGATTTC，RAGEF: 5-GCTGGAATGGAAACTGAACACAGG，RAGER: 5-TTCCCAGGAATCTGGTAGACACG，IGF-1RF: 5-CGATGT GTGAGAAGACCACCA，IGF-1RR: 5-ACATTTTCTGGCAGCGGTTT，(由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成)。1.8 總RNA提取與cDNA的合成按照操作說明書進(jìn)行樣本組織總RNA提取和cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)配液為：5×ExScriptTM Buffer 2

7、 l，dNtp 0.5 l，olidt 0.5 l，ExScript TMR Tase 0.25 l，RNase inhibitor 0.25 l，Total RNA 0.4 g，RNase Free dH2O補到10l。42反應(yīng)15 min，95加熱2 min，-20保存?zhèn)溆谩崟rPCR反應(yīng)的配液為：SYBR Premix Ex Taq 25l，PCR Forward primer 1l，PCR reverse Primer 1 l，Dye 1 l，模板(cDNA溶液) 2 l，d H2O 20 l。反應(yīng)條件設(shè)置為:95，10 s,然后95，5 s，60，31 s進(jìn)行40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，

8、得到所的標(biāo)本的記錄點曲線。軟件自動進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算出Ct(Threshold cycle)值。1.9 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組計量資料均以±s表示。用One-way ANOVA(單因素方差分析)進(jìn)行各組間的比較。2 結(jié)果RAGE值各證型組組間無統(tǒng)計學(xué)意義，但與正常組相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); IGF值各證型組組間無統(tǒng)計學(xué)意義，但與正常組相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表1。表1 各糖尿病足證型組與正常對照組RAGE、IGF-1R的基因水平3 討論糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)高糖條件下，蛋白質(zhì)的氨基與糖的醛基在非

9、酶催化的化學(xué)反應(yīng)下生成糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)，引起局部皮膚組織 AGEs 蓄積24。AGEs 通過直接作用和受體途徑引起組織、細(xì)胞功能的紊亂57。AGEs 可導(dǎo)致其它蛋白質(zhì)的糖基化;生長因子及其受體糖基化使具有功能活性的生長因子及其受體減少，或信號分表達(dá)和功能發(fā)生變化，進(jìn)而影響修復(fù)細(xì)胞的增殖及遷移，從而影響創(chuàng)面修復(fù)。終末糖基化產(chǎn)物受體(RAGE)是一種膜蛋白，屬于免疫球蛋白家族，由400多個氨基酸組成，分子量為35kD，分胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段，在單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中普遍表達(dá)。RAGE作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體介導(dǎo)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和其配體在細(xì)胞

10、表面結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,在糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生中起重要作用。和其他受體不同，RAGE的作用并非清除體內(nèi)的AGES，而是介導(dǎo)并放大了細(xì)胞對AGE的大部分應(yīng)答反應(yīng)8。AGES與RAGE結(jié)合可以引發(fā)多種效應(yīng)，可以激活某些關(guān)鍵的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑9，如NF-B途徑、Janus激酶一信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)途徑等，激活一些細(xì)胞豁附分子的關(guān)鍵基因，從而誘導(dǎo)多種氧自由基以及細(xì)胞因子如促凝血因子、內(nèi)皮素-1、血管細(xì)胞粘附分子-1 ( VCAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)，IL-6，TNF-, VEGF, TGF-, IGF-1等的產(chǎn)生，從而引起血管內(nèi)皮損傷、血流動力

11、學(xué)和血液流變學(xué)異常、細(xì)胞基質(zhì)異常增生以及新生血管形成等一系列病理變化，持續(xù)性的慢性炎癥反應(yīng)阻礙了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、塑型、及傷口愈合10。本實驗中RAGE呈高水平表達(dá)，三個證型間表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義，這有可能是糖尿病足難愈的因素之一。同時說明RAGE的表達(dá)水平在基因?qū)用嫔胁荒茏鳛橹嗅t(yī)辨證分型的特異性指標(biāo)。成熟的IGF-1R是由兩個亞基和兩個 亞基通過二硫鍵結(jié)合而形成的四聚體。IGF-1與亞基特異性結(jié)合，引起 亞基上酪氨酸殘基自身磷酸化后，通過激活磷脂酰肌醇信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，加速傷口愈合11。IGF-1與其受體特異性結(jié)合后引起的信號通路不僅參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，而且還能夠抑制細(xì)胞

12、趨向凋亡12。近期研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面修復(fù)遲緩的根本原因在于細(xì)胞因子受體或其下游信號分子表達(dá)和功能發(fā)生了變化，影響細(xì)胞因子引起的信號傳遞和核內(nèi)目的基因表達(dá)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍組織中，有研究顯示在潰瘍組織細(xì)胞因子蛋白表達(dá)減少的同時，導(dǎo)致 IGF-1R 低表達(dá)，引起其抗凋亡的活性減弱，使得處于低氧和缺乏營養(yǎng)環(huán)境中的組織修復(fù)細(xì)胞大量凋亡，最終導(dǎo)致肉芽組織生長緩慢，數(shù)量減少，傷口愈合延遲。因此潰瘍組織內(nèi)IGF-1R 蛋白低表達(dá)可能是創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞趨向凋亡，傷口愈合遲緩形成潰瘍的原因之一13，本實驗從分子層面部分解釋了糖尿病足患者瘡面難愈，最終導(dǎo)致截肢的部分病理機(jī)制，其它可能的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探討。兩個指標(biāo)

13、在三種中醫(yī)辨證分型中沒有統(tǒng)計學(xué)差異，可以認(rèn)為在截肢這一糖尿病并發(fā)癥的嚴(yán)重階段這兩個指標(biāo)與中醫(yī)證型的關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，尚不能作為中醫(yī)辨證分型的微觀依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 陳宜張.分子神經(jīng)生物學(xué)M.北京:人民軍醫(yī)出版社,1995:247.2 Nessar Ahmed. Advanced glycation endproducts-role in pathology of diabetic complicationsJ. Diabetes Research and Clinical Practice，2005，67:3.3 Stiss AW，Jenkins AJ，Cooper ME. Advanced g

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