涎腺腫瘤中Survivin蛋白的表達(dá)及意義

1、涎腺腫瘤中Survivin蛋白的表達(dá)及意義 作者：齊紅，王康敏，梁永強(qiáng)，楊荔琳【關(guān)鍵詞】 涎腺腫瘤 摘要：目的 探討涎腺腫瘤中Survivin蛋白的表達(dá)情況，明確其表達(dá)與涎腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及臨床病理的關(guān)系。方法 制備組織芯片，應(yīng)用pictureTM法進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果 Survivin蛋白在涎腺良性腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于交界性腫瘤、惡性腫瘤及癌旁腺體中的表達(dá)(P均<0.005)；交界性腫瘤與惡性腫瘤中的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)；而惡性腫瘤中的表達(dá)高于癌旁腺體中的表達(dá)，且差異有顯著性(P<0.01)。在惡性腫瘤中，低分化者的Surviv

2、in陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高分化者(P<0.0005)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.0005)；復(fù)發(fā)瘤明顯高于原發(fā)瘤(P<0.05)；而不同性別、年齡及不同大小的腫瘤間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 Survivin蛋白表達(dá)與涎腺惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，可作為涎腺惡性腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷的可靠指標(biāo)。關(guān)鍵詞：涎腺腫瘤；Survivin；組織芯片；免疫組織化學(xué)The study on expression of survivin protein in salivary gland tumor2 / 20ABSTR

3、ACT: Objective To discuss the Survivin protein expression in different salivary gland tumor. Methods This experiment was based on tissue chip technology. Expression of Survivin protein in the salivary gland tumor was analyzed with immunohistochemical methods. Results Survivin expression showed signi

4、ficant difference in the salivary gland benign and malignant tumors (P<0.005), and relay tumors(P<0.005). The positive expressions were almost the same in relay and malignant tumors(P>0.05). The gland around the malignant tumor showed diversity compared with malignant tumor (P&a

5、mp;lt;0.01). The Survivin expression showed remarkable correlation with histological differentiation degree(P<0.0005), lymph node transfer(P<0.0005), and relapse(P<0.05), but it had nothing to do with the patient sex, age and the size of the tumor (P>0.05). Conclusion Sur

6、vivin expression has correlation with the relay tumor canceration, and the gland around malignant tumor has correlation with occurrence, progress, prognosis in the salivary gland malignant tumor, and it is a reliable marker of earlier period diagnosis and prognosis of the malignant tumor of salivary

7、 gland.KEY WORDS: salivary gland tumor; Survivin; tissue chip; immunohistochemistry涎腺腫瘤是最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤，不僅威脅患者的生命和身心健康，而且影響美容。如何提高涎腺腫瘤的診斷和治療水平，提高患者的生存率及生存質(zhì)量是涎腺腫瘤研究中需要迫切解決的問(wèn)題。Survivin作為一種新的凋亡蛋白抑制因子(IAP)，以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、特殊的組織分布及明顯的抗凋亡作用，使其在多數(shù)腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用日益為人們所重視，其作為腫瘤診斷標(biāo)記物和基因治療靶點(diǎn)的研究已初露端倪。1 材料與方法1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔

8、醫(yī)院1998年至2002年存檔涎腺腫瘤標(biāo)本118例。其中良性腫瘤27例：基底細(xì)胞腺瘤(BCA)7例，肌上皮瘤(ME)6例，多形性腺瘤(PA)14 例；交界性腫瘤10例：交界性肌上皮瘤1例，交界性多型性腺瘤9例；惡性腫瘤81例：癌在多形性腺瘤中(MPA)11例，黏液表皮樣癌(MEC)12例，腺樣囊性癌(ACC)25例，腺泡細(xì)胞癌(SCA)10例，腺癌(NOS)12例，乳頭狀囊腺癌(PCAC)5例，腺鱗癌(AEC)3例，導(dǎo)管癌(SDC)3例。其中高分化癌51例，中、低分化癌30例。癌旁腺組織60例。另取人胚胎8周腮腺1例，人正常頜下腺及腮腺各1例，狗正常頜下腺1例。40g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟

9、包埋。1.2 主要試劑 鼠抗人Survivin單克隆抗體為美國(guó)Santa Crus公司產(chǎn)品；免疫組化PV6000試劑盒及DAB顯色試劑盒為Zymed公司產(chǎn)品，均購(gòu)自北京中山公司。1.3 方法1.3.1 組織芯片的制備 采用人工方法制備涎腺腫瘤組織芯片。蠟塊切片經(jīng)資深專家復(fù)核、診斷和分型，標(biāo)記有關(guān)區(qū)域。設(shè)計(jì)點(diǎn)陣，制作受體臘塊，打孔，采集組織芯，放在受體蠟塊相應(yīng)點(diǎn)陣孔上(孔深3mm，間距0.1cm)，同時(shí)記錄樣本位置。保證樣本處于同一平面，冷卻保存,制蠟塊兩塊，5m連續(xù)切片，40裱片，HE染色各1張?jiān)u定芯片質(zhì)量，其余裱于多聚賴氨酸膠片上，經(jīng)56烤片3h后，37恒溫箱中過(guò)夜，-20冰箱中待用。免疫組

10、織化學(xué)染色采用PictureTM法染色(一步法)。PBS代替一抗做替代對(duì)照。1.3.2 陽(yáng)性結(jié)果判定 由兩位病理醫(yī)師在不知道任何臨床和病理資料的情況下對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行描述、評(píng)估。以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。將陽(yáng)性細(xì)胞按其數(shù)量及染色強(qiáng)度分為3級(jí): 弱陽(yáng)性表達(dá)(+)，即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于10%，顯色強(qiáng)度為淡黃色或僅個(gè)別細(xì)胞呈黃至棕黃色染色；強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)()，即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為60%以上，多數(shù)細(xì)胞呈黃至棕黃色染色，染色強(qiáng)度為中至強(qiáng)陽(yáng)性，少數(shù)細(xì)胞可為弱陽(yáng)性表達(dá)；中度陽(yáng)性()，即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及顯色強(qiáng)度介于弱陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性兩級(jí)之間；陰性()，為染色強(qiáng)度與背景無(wú)明顯差別。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 構(gòu)成比資料采用2檢驗(yàn)，單向有

11、序列聯(lián)表資料采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 組織芯片的質(zhì)量評(píng)定 2個(gè)組織芯片蠟塊共切片60張HE切片。載玻片上組織陣列整齊，193個(gè)微組織塊無(wú)脫失，有6塊組織部分折疊或部分缺失，其余組織形態(tài)保存完好，完好率96.89%>85%，芯片質(zhì)量肯定(圖1)。圖1 涎腺腫瘤組織芯片（略）Fig.1 Tissue chip of the salivary gland tumora: paraffin blok of tissue chip; b: HE; c: immunohistochemistry2.2 Survivin 蛋白在涎腺不同組織中的表

12、達(dá)分布特征 Survivin陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分可見(jiàn)胞核著色，為粗細(xì)不一的棕黃色顆粒，瘤細(xì)胞周圍背景清晰，其表達(dá)情況如下：在胚胎腮腺組織中，腺泡及導(dǎo)管中Survivin 蛋白均呈陽(yáng)性表達(dá)(圖2a)；正常人、狗涎腺組織中腺泡均未見(jiàn)Survivin蛋白表達(dá)，而紋管、閏管上皮見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2b)。在良性腫瘤中，BCA、ME均無(wú)Survivin 蛋白表達(dá)；PA陽(yáng)性表達(dá)1例,且該例陽(yáng)性主要表達(dá)于鱗狀化生區(qū)。在交界性PA中，陽(yáng)性主要表達(dá)于腫瘤性上皮細(xì)胞，包括導(dǎo)管結(jié)構(gòu)內(nèi)層的腺管上皮細(xì)胞和外層的肌上皮細(xì)胞，肌上皮團(tuán)塊及鱗狀化生區(qū)域的細(xì)胞漿中亦有表達(dá)，而在黏液軟骨樣區(qū)幾乎不表達(dá)(圖2c)。在惡性腫瘤

13、中，MEC中Survivin在中間細(xì)胞、表皮樣細(xì)胞均可見(jiàn)胞漿表達(dá)，而黏液細(xì)胞僅部分病例中可見(jiàn)表達(dá)(圖2d、e)；MPA中惡性部分的陽(yáng)性表達(dá)同其相同類型的惡性腫瘤的表達(dá)一致，良性部分同交界性PA的表達(dá)一致(圖2f)；NOS中在腫瘤性上皮大部分呈陽(yáng)性表達(dá)，多數(shù)定位于胞漿(圖2g)；PCAC中腫瘤性腺上皮均示胞漿表達(dá)(圖2h)；ACC中腺上皮表達(dá)強(qiáng)于肌上皮表達(dá)(圖2i，j)；AEC中鱗癌成份表達(dá)強(qiáng)度及數(shù)量均大于腺癌成份(圖2k)；SDC中幾乎腫瘤細(xì)胞胞漿均有表達(dá)(圖2m)；SCA均為細(xì)胞漿表達(dá)，較均勻且較弱(圖2n)，而淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移性腺癌陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)(圖2o)。在癌旁腺體中，除紋管、閏管陽(yáng)性表達(dá)外，

14、31.67%的癌旁腺體存在腺泡及大導(dǎo)管強(qiáng)弱不等陽(yáng)性表達(dá)(圖2p)。圖2 正常涎腺組織、涎腺腫瘤及癌旁腺體涎腺中Survivin蛋白的表達(dá)（略）Fig.2 The expression of Survivin via immunohistochemistry method in the salivary gland, the salivary gland tumor, and the gland around the malignant tumor PictureTM×200a:embryonic parotid gland; b: normal salivary gland; c:

15、the gland around the malignant tumor; d,e: mucoepidemoid carcinoma; f: malignant pleomorphic adenoma; g: adenocarcinoma; h,i: adenoid cystic carcinoma ; j: adenoid cystic carcinoma ; k,l: adenoid cystic carcinoma; m: relay pleomorphic adenoma; n: papilary cystadenocarcinoma; o: ductal carcinoma; p:

16、the metastasis of adenocarcinoma in lymph node2.3 Survivin 蛋白在涎腺腫瘤中的表達(dá)2.3.1 Survivin蛋白在涎腺良性、交界性、惡性腫瘤及癌旁腺體中的表達(dá) Survivin蛋白在涎腺良性腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于在交界性腫瘤、惡性腫瘤及癌旁腺體中的表達(dá)(P均<0.005)；交界性腫瘤與惡性腫瘤中的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)；而惡性腫瘤中的表達(dá)明顯高于癌旁腺體中的表達(dá)，且差異有顯著性(P<0.01，表1)。在免疫組化芯片中，1例組織芯(PA) 脫失，未計(jì)入統(tǒng)計(jì)結(jié)果。表1 涎腺良性、交界

17、性、惡性腫瘤及癌旁腺體中Survivin蛋白的表達(dá)（略）Table 1 Expression of survivin protein in benign tumor, relay tumor, malignant tumor, and the gland around the malignant tumor of the salivary gland2.3.2 涎腺惡性腫瘤中Survivin蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 在惡性腫瘤中，低分化者的Survivin陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高分化者(P<0.0005)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.0005)；復(fù)發(fā)瘤

18、明顯高于原發(fā)瘤(P<0.05)；而不同性別、年齡及不同大小的腫瘤間均無(wú)顯著性差異(P>0.05，表2)。3 討論目前研究已揭示，Survivin參與了細(xì)胞周期調(diào)控，與多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。Survivin在成熟組織中很少表達(dá)，僅在胚胎組織和發(fā)育過(guò)程中的組織中表達(dá)。當(dāng)正常細(xì)胞惡變時(shí)Survivin表達(dá)，在轉(zhuǎn)化系細(xì)胞和惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)。目前有關(guān)Survivin在涎腺腫瘤中的表達(dá)研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以組織芯片技術(shù)為依托，采用免疫組化PictureTM法檢測(cè)涎腺腫瘤中Survivin蛋白的表達(dá)(PictureTM檢測(cè)方法只使用抗體的抗原結(jié)合片

19、段，可以完全避免內(nèi)源性生物素和抗體FC段可能造成的背景染色，敏感而特異性強(qiáng))，旨在將Survivin引入涎腺腫瘤的研究領(lǐng)域，探討Survivin在涎腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。本研究結(jié)果顯示，在正常涎腺中，Survivin表達(dá)有一定的特殊性。我們所做的3例人正常腮腺、頜下腺組織及1例狗涎腺組織，腺泡中均未見(jiàn)Survivin蛋白表達(dá)，而紋管、閏管上皮均見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)。這與以往大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)Survivin在人體組織中除了在胎盤(pán)、胸腺及結(jié)腸隱窩中微弱表達(dá)外，其他組織中均未檢測(cè)到其表達(dá)13的結(jié)果有所不同。我們考慮紋管上皮可能與閏管上皮相同，可多向分化，具有干細(xì)胞潛能，因此推測(cè)涎腺腫瘤的發(fā)生可能與紋管、閏

20、管有關(guān)。表2 涎腺惡性腫瘤中Survivin蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系（略）Table 2 Expression of survivin protein in salivary gland malignant tumor本研究結(jié)果還顯示，涎腺良性腫瘤與交界性腫瘤、惡性腫瘤相比，Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率均有顯著性差異(P<0.005)，提示Survivin基因的翻譯表達(dá)與涎腺良性腫瘤的發(fā)生無(wú)關(guān)，而與涎腺惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。涎腺交界性腫瘤與惡性腫瘤中Survivin 蛋白陽(yáng)性表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明交界性腫瘤具有惡變潛能，Survivin基因在涎腺

21、腫瘤惡性改變的早期就發(fā)揮著重要作用，有望成為涎腺腫瘤早期診斷的標(biāo)志物。Noriyuki等4對(duì)31例子宮內(nèi)膜癌的研究結(jié)果表明，級(jí)Survivin陽(yáng)性表達(dá)率為43.5%,級(jí)為49.3%，級(jí)為73.2%,級(jí)為88%，、級(jí)分別與、級(jí)比較存在顯著差異，指出Survivin表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的分化程度有關(guān)。同樣，Lehner等5也證實(shí)了Survivin的表達(dá)與子宮癌的分化程度有關(guān)。本研究結(jié)果提示，在涎腺惡性腫瘤中，Survivin蛋白的表達(dá)與涎腺腫瘤的分化程度有關(guān)，即分化程度越高Survivin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越低，與上述研究結(jié)果一致。Survivin蛋白表達(dá)與涎腺惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在本研究中，16

22、例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中，15例Survivin蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為93.75%，且陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)，提示Survivin基因上調(diào)可能促使涎腺腫瘤的轉(zhuǎn)移。Sarela等6對(duì)144例結(jié)直腸癌的研究結(jié)果提示，Survivin表達(dá)預(yù)示著結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Survivin 陰性者5年生存率為 94.4%，而陽(yáng)性者僅為44.8%，與本研究在涎腺腫瘤中得出的結(jié)論一致。Survivin蛋白表達(dá)與涎腺惡性腫瘤的復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究中11例復(fù)發(fā)病例81.81% Survivin陽(yáng)性表達(dá)，而非復(fù)發(fā)病例表達(dá)率為47.69%，二者存在顯著性差異(P<0.05),與Takamizawa等7在腎腫瘤研究得出的

23、Survivin陽(yáng)性者中82%復(fù)發(fā)的研究結(jié)果一致。同時(shí)，本研究中Survivin蛋白表達(dá)與涎腺惡性腫瘤患者的性別、年齡、腫瘤的大小均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，支持了Monzo等8對(duì)83例非小細(xì)胞肺癌的研究結(jié)果。綜上所述， Survivin蛋白的表達(dá)與涎腺惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)程度越高，凋亡細(xì)胞越少，腫瘤惡性程度越高，轉(zhuǎn)移可能性越大，其預(yù)后越差。Survivin被激活的機(jī)理，目前尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel antiapoptosis gene, Survivin e

24、xpressed in cancer and lymphoma J. Nature Med, 1997,3(8):917921.2Shin S, Sung BJ, Cho YS, et al. An antiapoptotic protein human Survivin is a direct inhibitor of caspase3 and7 J. Biomistry, 2001, 40(4):11171123.3Rohayem J, Diestelkoetter P, Weigle B, et al. Antibody response to the tumorassociated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients J. Cancer Res, 2000,60(7): 18151817.4 Noriyuki Takai, Tami Miyazaki, Masakazu Nishida, et al. Survivin expression correlate