大鼠彌漫性腦損傷后Homer蛋白的表達及其意義

1、大鼠彌漫性腦損傷后Homer蛋白的表達及其意義 作者：史鐵鈞，費舟，章翔，黃衛(wèi)東，梁景文，宋蕾【關(guān)鍵詞】 彌漫性腦損傷 Expression of Homer after diffuse brain injury in rats and its significance【Abstract】 AIM: To study the expression and significance of Homer in diffuse brain injury（DBI）of rat in vitro. METHODS: One hundred and five SD rats, weighing（300

2、77;25）g, were randomized to normal, shamoperated and DBI groups. The Marmarou rats were applied to DBI group and the shamoperated group was treated as DBI group except for “free fall” attack. The rats main brain areas and nuclei were taken to detect for Homer by immunoblotting at 0.5, 1, 6, 12, 24,

3、72 and 168 h after injury respectively. RESULTS: Homer1a was positive in DBI group from 0.5 h to 168 h after injury but no Homer1a was observed in normal group and shamoperated group. Homer1b/c, Homer2a/b and Homer3 were present in the normal, shamoperated and DBI groups. CONCLUSION: There is a sign

4、ificant change in Homer1a expression before and after injury, but there is no significant change in Homer1b/c, Homer2a/b and Homer3 levels, which indicates that Homer1a is involved in the neuronal injury and may protect neurons from insults.2 / 12【Keywords】 Homer; immunoblotting; diffuse brain injur

5、y; rats【摘要】 目的： 研究大鼠彌漫性腦損傷后不同亞型Homer蛋白表達規(guī)律及其意義. 方法： SD大鼠105只，體質(zhì)量（300±25） g，分為正常組、假手術(shù)組和彌漫性腦損傷(DBI)組， DBI組應(yīng)用Marmarou大鼠致傷，假手術(shù)組不予以自由落體打擊，其余處理同DBI組，分別在損傷后0.5, 1, 6, 12, 24, 72, 168 h取大鼠主要腦區(qū)及核團裂解勻漿，進行各Homer蛋白的免疫印跡分析. 結(jié)果： DBI組神經(jīng)組織中Homer1a蛋白的表達自傷后0.5 h起持續(xù)至傷后168 h，而正常及假手術(shù)組未見該蛋白陽性表達；Homer1b/c, Homer2a/b和

6、Homer3在正常組、假手術(shù)組和DBI組均可見明確的陽性表達. 結(jié)論： 大鼠彌漫性腦損傷后Homer1a蛋白的表達于損傷前后有顯著變化，而Homer1b/c, Homer2a/b及Homer3于損傷前后無明顯變化，提示Homer1a蛋白參與了神經(jīng)元損傷過程,且可能對神經(jīng)元損傷起到一定的保護作用.【關(guān)鍵詞】 Homer；免疫印跡法；彌漫性腦損傷；大鼠0引言1997年Brakeman等首次發(fā)現(xiàn)Homer，目前Homer家族已分為3型(Homer1,Homer2和Homer3)，其中Homer1是唯一在外來刺激后高表達的家族蛋白，每型還有多種剪切變異，如Homer1a, Homer1b和Homer1

7、c等. Homer1a是一種即早基因（immediately early gene, IEG）產(chǎn)物，它在細胞中呈動態(tài)表達,而隨后又發(fā)現(xiàn)Homer1b, Homer1c,Homer2a, Homer2b及Homer3等，通常在多種神經(jīng)元的突觸后膜上表達，除含有與Homer1a相同的EVH1（Ena/VASP homology 1）結(jié)構(gòu)域外，還在C端包含有一段卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域. 我們研究在大鼠彌漫性腦損傷(DBI)模型基礎(chǔ)上Homer蛋白分子的表達及其意義.1材料和方法1.1材料健康成年雄性SD大鼠105只，體質(zhì)量為（300±25）g，第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供. 各Homer蛋白亞型的

8、多克隆抗體均購自SantaCruz公司，不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）低分子量標準蛋白及BCIP/NBT顯色盒購自武漢博士德公司.1.2方法 1.2.1動物分組及模型制作SD大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組及損傷組，其中損傷組據(jù)標本采集時間又劃分為0.5, 1, 6, 12, 24, 72, 168 h等7個亞組，每組5只，即在7個時間點劃入實驗范圍的大鼠均為15只，損傷組采用Marmarou大鼠DBI模型1，假手術(shù)組僅不予以自由落體打擊，其余處理同損傷組.1.2.2取材各組大鼠至預(yù)定時間后，常規(guī)麻醉，斷頭取腦，選取額頂葉皮層及海馬區(qū)神經(jīng)組織混合多去污劑裂解緩沖液于裂解器內(nèi)裂解勻漿，勻

9、漿液高速離心（15000 g, 15 min）后取上清液冷凍保存.1.2.3免疫印跡技術(shù)檢測待樣本制備完成后，分別行各亞型Homer蛋白免疫印跡技術(shù)檢測，BCIP/NBT顯色.2結(jié)果Homer1a及Homer1b/c蛋白陽性表達可見于額頂葉皮層及海馬區(qū)神經(jīng)組織，其中Homer1a分子于腦損傷后0.5 h起出現(xiàn)，持續(xù)至傷后168 h，正常組及假手術(shù)組均未見陽性表達；而Homer1b/c分子在正常組、假手術(shù)組及機械損傷組均可見陽性表達，在神經(jīng)組織內(nèi)的分布與Homer1a基本相同. Homer2a/b及Homer3分子的陽性表達主要見于海馬區(qū)神經(jīng)組織，而額頂葉皮層組織僅有微量表達（Fig 1）.3討

10、論近年來，不同的Homer基因剪切變異型不斷被發(fā)現(xiàn)，到目前為止共有10余種，但從總體上可將其分為2大類，即短Homer和長Homer2. Homer1a蛋白的表達受神經(jīng)元興奮性活動的調(diào)節(jié)，癲癇、高頻刺激、光刺激及發(fā)育過程中海馬或皮層神經(jīng)元的興奮性突觸活動可快速誘導(dǎo)Homer1a mRNA表達水平增加3，4. 我們已經(jīng)通過石蠟切片的免疫組織化學(xué)方法證實： 大鼠DBI后，其額頂葉皮層神經(jīng)元中Homer1a蛋白表達明顯增強，而Homer1b/c等長Homer分子則于腦損傷前后無顯著變化，不受神經(jīng)元興奮性活動的調(diào)節(jié).以往研究表明： 雖然大鼠DBI后腦皮層內(nèi)三組代謝性谷氨酸受體（mGluRs）表達均有改

11、變，但以mGluR1a變化最為明顯，是加重神經(jīng)元損傷的主導(dǎo)因素5，而該組受體具有非激動劑依賴性活性（agonistindependent activity），即在沒有激動劑存在下，它仍可以介導(dǎo)細胞內(nèi)IP3的升高及Ca2+依賴的K+通道開放6，這種活性是由細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Homer所介導(dǎo)的. 長、短Homer分子通常相互競爭，起拮抗作用. 長Homer依靠它們特有的CC螺旋結(jié)構(gòu)形成多聚體，有效連接第I組mGluR和IP3R分子，使刺激信號很快通過這種連接激活I(lǐng)P3R，引起胞內(nèi)Ca2+的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞的進一步損傷，而短Homer1a表達受多種刺激因素調(diào)控，其表達作用是選擇性阻斷長Homer

12、分子多聚體與第I組mGluR的結(jié)合，延緩IP3R分子的激活，減少或延緩胞內(nèi)Ca2+的進一步釋放7. 因此，我們認為Homer分子對第組mGluRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控有重要作用，且短Homer分子Homer1a在神經(jīng)元損傷過程中起到了一定的保護作用.本實驗通過建立穩(wěn)定的Marmarou大鼠DBI模型，依據(jù)免疫印跡分析技術(shù)及前述多項研究得知： 彌漫性腦損傷后，Homer1a分子出現(xiàn)明確的動態(tài)表達，自傷后30 min起持續(xù)表達至傷后168 h，而Homer1b/c, Homer1b2a/b及Homer1b3的表達于致傷前后無明顯變化，是一種基本表達. 長短Homer分子與第組mGluR的競爭結(jié)合提示我們

13、：增加Homer1a表達或減少Homer1b/c, Homer1b2a/b及Homer3的表達可以改變mGluR受體信號的傳遞效率，可能對神經(jīng)元損傷起到保護作用，這為開發(fā)新型神經(jīng)保護劑提供了新的實驗依據(jù).【參考文獻】1 費舟，章翔，李樹合，等. 彌漫性腦損傷合并二次腦損傷腦組織谷氨酸及環(huán)核苷酸的改變J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2000;21(9):1064-1066.Fei Z, Zhang X, Li SH, et al. Alteration of glutamate and cyclic nucleotide in rat brain after diffuse brain injury w

14、ith secondary brain insults J. J Fourth Mil Med Univ, 2000;21(9):1064-1066.2 Soloviev MM, Ciruela F, Chan WY, et al. Molecular characterisation of two structurally distinct groups of human homers, generated by extensive alternative splicing J . Mol Biol, 2000;295(5):1185-1200.3 Bottai D, Guzowski JF

15、, Schwarz MK, et al. Synaptic activityinduced conversion of intronic to exonic sequence in Homer1 immediate early gene expression J . Neuroscience, 2002;22(1):167-175.4 Nielsen HS, Georg B. Homer1 mRNA in the rat suprachiasmatic nucleus is regulateddifferentially by the retinohypothalamic tract tran

16、smitters pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and glutamate at time points where light phaseshifts the endogenous rhythm J . Mol Brain Res, 2002;105:79-85.5 何遠東，費舟，章翔，等. 大鼠腦損傷后大腦皮層代謝性谷氨酸受體1 a的表達變化及意義J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2001;22(7):612-615.He YD, Fei Z, Zhang X, et al. Gene expression of metabotropic glutamate receptor 1a after brain injury and efficacy of its antagonist MCPG J . J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(7):612-615.6 Ango F, Prezeau L, Muller T, et al. Agonistindepe