單羥基四苯基卟啉的合成及與BSA的作用new

1、單羥基四苯基卟啉單羥基四苯基卟啉及及配合物的合成及配合物的合成及與與BSA的作用實驗意義及原理卟啉化合物與生命科學(xué)密切相關(guān)，在生物體的多種生理機能中起著非常重要的 作用。許多生命現(xiàn)象都有卟啉及其配合物的參與，生物體所含的卟啉化合物主要包括血紅素、葉綠素、維生素B 12,節(jié)肢動物血液中含銅的卟啉化合物、以及海鞘類 動物血液中能與釩原子結(jié)合的雙吡咯基團（相當(dāng)于半個卟啉環(huán)等，所以卟啉及其配合 物的合成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)研究受到人們的重視。所有這些應(yīng)用的深入研究，均要求卟啉化合物具有活性基團。因此，帶有活性基團的卟啉化合物的合成及其生物活性研 究,成為卟啉化合物研究的熱點1-2,這其中包含系列羥基苯基卟啉化

2、合物。1. 卟啉及配合物合成路線：refluxpropionic acidCHOCHO2. 卟啉有強的紫外吸收，吸收光譜包括兩個不同的區(qū)域，在390425nm之間有一 個強烈的吸收帶（具體出現(xiàn)位置要取決于卟啉環(huán)是 B位取代還是中位取代，這一吸收 帶稱為B帶或Soret帶。另外有兩個或者4個較弱的吸收帶出現(xiàn)在480700nm稱 為Q帶，當(dāng)卟啉與金N N H NHNOH N N N N OH M(A c2CHCI 3M M =N i,Co,Z n ,Cu屬形成配合物后,Q帶的吸收峰由4個減至2個。這些帶的數(shù)目和強度能夠有 力地證明卟啉環(huán)的取代方式以及它是否含有中心金屬，同時帶的數(shù)目也是對卟啉的 光

3、譜進行分類的依據(jù)。卟啉和 BSA相互作用過程中，會導(dǎo)致卟啉Soret帶最大吸收 發(fā)生改變。3. 卟啉化合物對牛血清白蛋白(BSA的熒光猝滅效應(yīng)BSA的內(nèi)源熒光來自分子中色氨酸和酪氨酸殘基，卟啉化合物的加入能使其熒 光規(guī)律性猝滅。熒光猝滅過程通常由動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅之分。動態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程。遵從Stern-Volmer方程3:F0/F=1+K svQ=1+k q t 0Q(1靜態(tài)猝滅是卟啉分子(猝滅劑與BSA(熒光體分子在基態(tài)時形成不發(fā)光的配合物 或分子間復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光體發(fā)光強度的降低?？蛇m用于改進的 Stern-Volmer 方程4-5:1/(F-F0=1

4、/F0(1+K D/Q(2(F和F0分別為猝滅劑濃度等于Q和無猝滅劑時熒光體的相對熒光強度,K sv 為動態(tài)猝滅常數(shù),k q為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，T0無猝滅劑時熒光分子的平均壽命,對于生物大分,t O=10s,K D為復(fù)合物的解離平衡常數(shù)。K A為復(fù)合物的形成 穩(wěn)定常數(shù),K A=1/K D。各種猝滅劑對生物分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)2.0 >1010（mol/L-1.s-1,如果大大超出此數(shù)值，一般可以認為是靜態(tài)猝滅。二、實驗?zāi)康?. 熟悉卟啉及其配合物的合成和性質(zhì)；2. 學(xué)習(xí)卟啉與生物大分子相互作用的原理；3. 學(xué)習(xí)用紫外/熒光實驗研究有機分子與生物大分子相互作用的實驗技術(shù)和數(shù) 據(jù)

5、處理。三、試劑與儀器1.試劑：新蒸吡咯（M=67.09,4-羥基苯甲醛（M=122.12,苯甲醛（M=106.13,丙酸（b.p=137 141 T ,乙醇，甲醇，硅膠（100-200目牛血清白蛋白（BSAQMF,二次水。2儀器：UV-1601紫外/可見光譜儀（日本島津公司；Schimadzu RF-5301熒光光譜 儀,Varian-Mercury300超導(dǎo)核磁共振儀，Shiadzu FTIP-8100紅外光譜儀。四、實驗步驟1.5- （4-羥基苯基-10,15,20-三苯基卟啉的合成6250mL三頸燒瓶裝上恒壓滴液漏斗、回流冷凝管，瓶中加入100mL丙酸,加熱控 制油浴溫度為140C左右,

6、使丙酸微沸。依次加入對羥基苯甲醛 1.17g（9.57mmol,苯 甲醛2.67mL(26.3mmol,攪拌使之溶解。然后通過恒壓滴液漏斗滴加新蒸餾的吡咯 2.43mL(35mmol, 5min內(nèi)滴加完畢。繼續(xù)加熱，在丙酸微沸的條件下攪拌回流 30- 45min。停止加熱，冷卻至3035°C后減壓蒸餾出丙酸70mL,冷卻到80C左右時加入 80mL無水乙醇,析出紫色固體，抽濾，用乙醇洗滌紫色固體，干燥，得到紫色固體卟啉混 合物。2.5- (4-羥基苯基-10,15,20-三苯基卟啉的分離純化將得到的混合物，在硅膠柱上層析分離，用氯仿淋洗，收集第一帶，經(jīng)薄層色譜分析 鑒定為四苯基卟啉。

7、然后用氯仿/甲醇(體積比為100:1做淋洗劑收集第二帶。蒸發(fā) 濃縮后用氯仿和甲醇重結(jié)晶，得到紫色晶體。即為產(chǎn)物5-(4-羥基苯基-10,15,20-三苯 基卟啉(C44H30N4O,M=630.24,產(chǎn)率 5%,m.p.> 300C。注意:氯仿回收重復(fù)使用、用薄層色譜監(jiān)測分離效果及產(chǎn)物。3.5- (4-羥基苯基-10,15,20-三苯基卟啉配合物的合成50mL燒瓶裝上回流冷凝管，瓶中加入20mL CHCI3,20mg5-(4-羥基苯基-10,15,20-三苯基卟啉,20mg醋酸鋅,加熱回流30-45min。用薄層色譜監(jiān)測反應(yīng)進程， 直到原料消失。蒸干溶劑，將得到的混合物用少量氯仿溶解，在

8、硅膠柱上層析分離，用 氯仿淋洗，用薄層色譜鑒測，收集第二帶。蒸發(fā)濃縮后用氯仿和甲醇重結(jié)晶，得到紫色 晶體。即為產(chǎn)物Zn-5-(4-羥基苯基-10,15,20-三苯基卟啉，m.p.> 300C。其它卟啉配 合物的合成方法相同。4.5- (4-羥基苯基-10,15,20-三苯基卟啉及配合物的結(jié)構(gòu)表征用紅外、核磁共振氫譜、紫外和質(zhì)譜進行結(jié)構(gòu)表征。5.卟啉及卟啉配合物(下稱卟啉和BSA相互作用的熒光光譜和紫外/可見光譜檢 測及數(shù)據(jù)處理A. 卟啉和BSA相互作用的熒光光譜及數(shù)據(jù)處理BSA的內(nèi)源熒光來自分子中色氨酸和酪氨酸殘基。熒光光譜測定中，激發(fā)波長 入ex= 290nmg過調(diào)節(jié)熒光儀激發(fā)和發(fā)射狹

9、縫的大小，使對照組的熒光強度在290- 500nm之間。卟啉化合物的加入能使 BSA的內(nèi)源熒光產(chǎn)生規(guī)律性猝滅。配制BSA(平均分子量 M=65000的水溶液(2 >10-6mol/L10mL,卟啉化合物的 DMF 溶液(4 X0-4mol/L10mL 0采用滴定法，在室溫(25C下測定熒光光譜。操作如下： 取平口的10或20L微量進樣器一支； 將熒光池中裝3mL BSA溶液，測定其在290-500nm的熒光光譜； 每次加入卟啉溶液(攪拌1分鐘,使之混合均勻，并測定其在290-500nm的 卄、/,熒光光譜;共計加入10次卟啉溶液，得到不同濃度卟啉作用下,熒光光譜的變化;(BSA與卟啉的濃

10、度比依次為 1:021:0.4,1:0.6,1:0.8,1:1.0,1:1.2,1:1.4,1:1.6,1:1.8,1:2.0 在Origin中作F0/F-濃度Q曲線,找出每條曲線熒光強度的最大值 F0或F,用F0/F=1+K svQ=1+k q t 0Q作動態(tài)猝滅處理 根據(jù)F0/F-濃度Q曲線，求出k q,當(dāng)k q>2.0采010(mol/L-1.s-1時，按靜態(tài)猝滅方程：1/(F-F0=1/F0(1+K D/Q處理作1/(F-F0-C曲線，求出K A和K D。B. 卟啉和BSA相互作用的紫外/可見光譜檢測及數(shù)據(jù)處理配制BSA（平均分子量 M=65000的水溶液（2 >10-4m

11、ol/L10mL,卟啉化合物的 DMF 溶液（4 X0-6mol/L10mL 0采用滴定法，在室溫（25C下測定紫外/可見光譜。操作如下： 取平口的10或20卩匚微量進樣器一支； 將比色皿中裝3mL卟啉溶液，測定其在390-700nm的紫外/可見光譜； 每次加入3卩L BSA溶液（攪拌1分鐘,使之混合均勻，并測定其在200-700nm 的紫外/可見光譜;共計加入10次BSA溶液,得到不同濃度BSA作用下，卟啉的紫外/ 可見光譜的變化；（卟啉與BSA的濃度比依次為1:0.2,1:0.4,1:0.6,1:0.8,1:1.0,1:12 1:141:1.6,1:1.8,1:2.0 在Origin中作A

12、-濃度Q曲線:以每條紫外吸收（約420nm曲線的最大值A(chǔ)為 縱坐標，濃度Q為橫坐標，作A-濃度Q曲線。觀察紫外吸收是否有紅移？用線性擬合觀 察卟啉和BSA相互作用后的紫外吸收變化的規(guī)律性。-BSA -體系（卟啉C. 紫外差譜:體系（卟啉-BSA將卟啉與BSA1:1結(jié)合體系的紫外/可見光譜，及相同濃度的卟啉的紫外/可見光 譜，將兩者相減,即得紫外差譜。將紫外差譜與相同濃度的 BSA紫外/可見光譜比較， 進一步確定熒光猝滅機制。注意事項：a在制取卟啉的過程中，丙酸必須保持微沸。溫度過高會加快吡咯的聚合，使產(chǎn)率降低反應(yīng)停止后，必須讓反應(yīng)溶液溫度降低到3040C左右,才能減壓蒸餾，否則容易 導(dǎo)致爆沸，

13、影響蒸餾進程。b配制BSA水溶液時，要使BSA充分溶解。c卟啉和BSA要充分混合,使反應(yīng)完全。d在進行光譜測定時，比色管、比色皿要洗滌干凈，測定前先用二次水洗滌，再用 少量被測溶液洗滌。由低濃度到高濃度依次測定。參考文獻：1 石偉民，陶京朝，吳健。卟啉及其衍生物合成進展J。化學(xué)通報,2005(10:751- 759.2 李向清，徐躍,石瑩巖等。系列羥基苯基卟啉單體的合成與表征J。自然科學(xué)進展,2002,12(2:201-204.3 陳國珍，黃賢智，許金鉤等。熒光分析法(第二版，北京:科學(xué)出版社，1990。4 Klotz I.M.,H unston D. L.Protein In terractio n with small moleculars.Relati on betwee n stoicchiometricbin di ng con sta ntsJ .J .Biol.Chem.,1975,250(8:30013009.5 Masami T.,Yutaka A.,Seizo M.etc.,Chem.Pharm.Bull.,1998,46