唾液乳桿菌Ren抗膽鹽脅迫反應(yīng)機(jī)制及轉(zhuǎn)錄因子TF0225在膽鹽脅迫應(yīng)激中的作用

1、唾液乳桿菌Ren 抗膽鹽脅迫反應(yīng)機(jī)制及轉(zhuǎn)錄因子TF0225 在膽鹽脅迫應(yīng)激中的作用唾液乳桿菌是人體腸道內(nèi)的原籍菌, 具有多種益生功效。腸道內(nèi)的膽鹽具有殺菌作用 , 能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu), 造成蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和DNA氧化損傷 , 因此能夠耐受生理?xiàng)l件下的膽鹽脅迫是唾液乳桿菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的必要條件。本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白組學(xué)相結(jié)合的手段, 對(duì)長(zhǎng)壽老人源Lactobacillus salivarius Ren膽鹽脅迫反應(yīng)中的差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定 , 并對(duì)其中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因進(jìn)行功能分析, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為全面揭示 L. salivariusRen 的膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制提供理論

2、基礎(chǔ) , 研究?jī)?nèi)容如下： (1) L. salivarius Ren 膽鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組和蛋白組圖譜的建立。將 L. salivarius Ren在含有 0.07%牛膽鹽 (Oxgall)的 MRS中進(jìn)行培養(yǎng) , 應(yīng)用基于第二代高通量測(cè)序的RNA-Seq方法篩選了 192個(gè)轉(zhuǎn)錄水平顯著變化的基因(log2 fold_change 1.5,p<0.001),其中 47 個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào) ,145 個(gè)基因下調(diào)。同時(shí)采用蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE) 和質(zhì)譜鑒定分離了44 個(gè)胞內(nèi)可溶性差異表達(dá)蛋白點(diǎn) (fold_change 1.25,p<0.05),其中表達(dá)豐度上調(diào)的

3、蛋白點(diǎn)15 個(gè), 下調(diào) 29 個(gè)；并且 31 個(gè)蛋白點(diǎn)在翻譯水平和轉(zhuǎn)錄水平同時(shí)呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)。結(jié)果表明 L. salivarius Ren的膽鹽脅迫響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。(2) 生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)L. salivarius Ren的膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制。利用Uniprot 、KEGG及 NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)的功能及參與的代謝通路 , 提出了 L. salivariusRen的膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制 , 主要包括：對(duì)麥芽糖和甘油的利用加強(qiáng) , 加速糖酵解以提高能量物質(zhì)的產(chǎn)生；增加賴氨酸與蘇氨酸的合成 , 以加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞表面的修飾提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成上調(diào)以加速膽鹽的泵出；

4、提高分子伴侶與氧化還原酶的合成, 應(yīng)對(duì)膽鹽造成的蛋白變性和氧化損傷；基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、 細(xì)胞分裂增殖及脂肪酸合成等進(jìn)程減慢；通過轉(zhuǎn)錄因子及雙組分系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞生理變化, 以適應(yīng)膽鹽脅迫環(huán)境。 (3) 轉(zhuǎn)錄因子 TF0225在 L. salivarius Ren膽鹽脅迫應(yīng)激中的調(diào)控機(jī)制。將 TF0225在 L.salivarius Ren 中進(jìn)行同源超量表達(dá) , 膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄因子超量表達(dá)菌株對(duì) 0.5%膽鹽的耐受能力是對(duì)照菌株的 23 倍。進(jìn)一步利用細(xì)菌單雜交和 MEME工具預(yù)測(cè)了 TF0225的 DNA結(jié)合位點(diǎn)保守基序 STKGMCA,并通過Target Explorer在 L. sali

5、varius Ren中篩選了 16 個(gè) TF0225 的靶基因。采用RT-qPCR分析了關(guān)鍵靶基因 .oppA 的轉(zhuǎn)錄水平 , 結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子超量表達(dá)菌株中 oppA 的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)2.33 倍, 證實(shí)了 TF0225對(duì) oppA 的負(fù)調(diào)控作用。(4) 靶基因 oppA 在 L. salivariusRen 膽鹽脅迫抗性中的功能分析。 將 oppA基因在 L. salivariusRen中進(jìn)行同源超量表達(dá) , 膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)表明oppA 超量表達(dá)的重組菌株對(duì)0.5%膽鹽的耐受能力是對(duì)照菌株的20 倍。單一成份膽鹽 (GCA、GDCA、TCA和 TDCA)的耐受實(shí)驗(yàn)表明 OppA可賦予重組菌株對(duì)?；撬峤Y(jié)合膽鹽特異的抗性。此外 ,OppA的超量表達(dá)還可顯著提高L. salivariusRen對(duì)高鹽 (7.5% NaCl)及高溫 (55 。 C)脅迫的耐受能力。這些結(jié)果表明OppA在 L. salivariusRen對(duì)抗多重脅迫的過程中發(fā)揮保護(hù)作用。綜上所述 , 本研究首次采用了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白