常用染色方法

1、主要內(nèi)容主要內(nèi)容v瑞氏染色法瑞氏染色法v網(wǎng)織紅細(xì)胞染色方法網(wǎng)織紅細(xì)胞染色方法v革蘭染色法革蘭染色法v抗酸染色法抗酸染色法2瑞氏染色法瑞氏染色法v 一、概述： 瑞氏染色法是目前最常用的血涂片染色方法。其染料由酸性伊紅和堿性美藍(lán)組成，美藍(lán)和伊紅的水溶液混合后，產(chǎn)生一種不溶于水的伊紅化美藍(lán)中性沉淀（ME），即瑞氏染料。將適量的ME溶解于甲醇中，即成為瑞氏染液。3瑞氏染色法瑞氏染色法v 二、細(xì)胞著色原理： 既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用。各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。如血紅蛋白、嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)合，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白、淋巴細(xì)胞、

2、嗜堿性粒細(xì)胞胞質(zhì)為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色或藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫紅色，稱為嗜中性物質(zhì)、原始紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞胞質(zhì)、核仁含較多酸性物質(zhì)，染成較濃厚的藍(lán)色；中幼紅細(xì)胞既含酸性物質(zhì)，又含堿性物質(zhì)，染成紅藍(lán)色或灰紅色；完全成熟紅細(xì)胞，酸性物質(zhì)徹底消失后，染成粉紅色。 4瑞氏染色法瑞氏染色法v 三、操作： 1. 制作血液或脫落細(xì)胞涂片，自然干燥固定； 2. 用蠟筆在血膜兩頭劃線，滴加瑞氏染液35滴以覆蓋整個(gè)血膜，固定12分鐘；滴加等量或稍多的緩沖液（未加緩沖液涂片上有染料顆粒殘留），吸球吹勻或搖動(dòng)玻片染色510分鐘； 3. 用流動(dòng)水從玻片的

3、一側(cè)沖去染液，自然干燥（或?yàn)V紙吸干）； 4. 鏡檢。 5瑞氏染色法瑞氏染色法v 四、注意事項(xiàng)： 1、PH對細(xì)胞染色有影響。由于細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)均為兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH值而定。在酸性環(huán)境中正電荷增多，已與酸性伊紅結(jié)合，染色偏紅；相反，則易與美藍(lán)結(jié)合，染色偏藍(lán)。因此，應(yīng)使用清潔中性的載玻片，稀釋染液必須用PH6.8緩沖液。沖洗玻片必須用流水。 2、染色的時(shí)間與染液濃度、染色時(shí)溫度成反比；而與細(xì)胞數(shù)量成正比。 3、沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)用流水沖去，以防染料沉淀在血膜上。 4、如血膜上有染料顆粒沉積，可加少許甲醇溶解，但需立即用水沖掉甲醇，以免脫色。6瑞氏染色法瑞氏染色法 5、染色過淡，可

4、以復(fù)染。復(fù)染時(shí)應(yīng)先加緩沖液，創(chuàng)造良好的染色環(huán)境，而后加染液，或加染液與緩沖液的混合液，不可先加染液。 6、染色過深可用水沖洗或浸泡水中一定時(shí)間，也可用甲醇脫色。 7、染色偏酸或偏堿時(shí)，均應(yīng)更換緩沖液再重染。 8、瑞氏染液的質(zhì)量好壞除了用血涂片實(shí)際染色效果評價(jià)外，還可采用吸光度比值RA評價(jià)。瑞氏染液的成熟指數(shù)以RA（A650nm/A525nm）=1.30.1為宜。78 中性桿狀核粒細(xì)胞 中性分葉核粒細(xì)胞 嗜酸性粒細(xì)胞 嗜堿性粒細(xì)胞 單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞網(wǎng)織紅細(xì)胞染色方法網(wǎng)織紅細(xì)胞染色方法v 一、概述： 根據(jù)網(wǎng)織紅細(xì)胞的形態(tài)特征和成熟程度將其分為五型：花冠型、絲球型、網(wǎng)型、破網(wǎng)型、點(diǎn)粒型。網(wǎng)織紅細(xì)胞經(jīng)

5、體外活體染色后，顯微鏡下凡含有兩個(gè)以上的深染顆?；蚓哂芯€網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的無核紅細(xì)胞，即為網(wǎng)織紅細(xì)胞。WHO推薦使用新亞甲藍(lán)染色液，因其對網(wǎng)織紅細(xì)胞染色力強(qiáng)且穩(wěn)定而被首推。 9網(wǎng)織紅細(xì)胞染色方法網(wǎng)織紅細(xì)胞染色方法v 二、操作： 1、取小試管一支，加入新亞甲藍(lán)染液2滴。 2、加入末梢血或EDTA抗凝靜脈血2滴于上述試管中，混勻。 3、室溫下放置15min后，取1滴制成薄片。 4、油鏡下至少計(jì)數(shù)1000個(gè)紅細(xì)胞中網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量。 5、計(jì)算： 網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)=計(jì)數(shù)1000個(gè)紅細(xì)胞中的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)/1000； 網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對數(shù)（個(gè)/L）=網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)*紅細(xì)胞數(shù)/L10網(wǎng)織紅細(xì)胞染色方法網(wǎng)織紅細(xì)胞染色方法

6、v 三、注意事項(xiàng)： 1、活體染色時(shí)間不能過短。室溫低時(shí)，放37恒溫箱。 2、最好制兩張片，每張計(jì)數(shù)1000個(gè)紅細(xì)胞，避免分布不均引起的誤差，涂片要薄而均勻，不使紅細(xì)胞重疊。 3、為計(jì)數(shù)方便，可于目鏡中放一中間有孔硬紙片或用Miller窺盤，縮小視野便于計(jì)數(shù)。 4、用瑞氏或瑞氏-吉姆薩染液復(fù)染后，可使網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果減少。 5、染液與血液比約為1：1，嚴(yán)重貧血時(shí)可適量增加血液的比例。11 Miller窺盤法窺盤法v由于目測計(jì)數(shù)誤差較大,用Miller窺盤法可減低標(biāo)準(zhǔn)誤,特別是RBC較少時(shí).v盤:厚1mm,直徑19mm,圓玻片上劃出格子:大方格內(nèi)Ret/(小方格內(nèi)RBCx9)X100%13網(wǎng)織紅

7、細(xì)胞革蘭染色法革蘭染色法v 一、基本原理： 革蘭染色是細(xì)菌最基本的染色法，可用于標(biāo)本涂片或菌落涂片。細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，約在PH2-5，一般情況下細(xì)菌帶負(fù)電荷，易于被帶正電荷的堿性染料（結(jié)晶紫，堿性復(fù)紅）著色。染色結(jié)果將細(xì)菌分為革蘭陽性（紫色）和革蘭陰性（紅色）兩類。14革蘭染色法革蘭染色法v 二、方法： 涂片干燥固定染色過程如下： 1、涂片經(jīng)火焰固定后，加結(jié)晶紫液染1min，清水沖去染液，倒去玻片上水。 2、加碘液染1min，水洗。 3、加脫色液（95%乙醇），不使搖動(dòng)10-30s，至無紫色脫落為止，水洗。 4、加復(fù)染液（堿性復(fù)紅液），染30s，水洗。 5、干后鏡檢。15革蘭染色法革蘭染色法v

8、 三、注意事項(xiàng)： 1、涂片：菌液涂片時(shí)，用接種環(huán)蘸取菌液直接在玻片上涂布；若是菌落，先取生理鹽水1滴，置于玻片上，用接種針挑取菌落，在鹽水中涂布。 2、干燥：制備的涂片應(yīng)自然干燥。 3、固定：多采用加熱固定，目的在于保持細(xì)胞原有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，殺死細(xì)菌，使染料易于著色，并是細(xì)菌附著于玻片上不易脫落。自然冷卻后在染色。 4、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。 1617G-菌G+菌抗酸染色法抗酸染色法v 一、基本原理： 分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時(shí)間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色抗酸染色。 齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為蘭色。18抗酸染色法抗酸染色法v 二、方法： 1、涂片經(jīng)火焰固定后，加石炭酸復(fù)紅溶液2-3滴，徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，切不可沸騰。染5min，冷卻后水洗。 2、加脫色劑（3%鹽酸酒精）30s-1min，不時(shí)搖動(dòng)玻片至紅