WB實(shí)驗(yàn)基本步驟

1、實(shí)驗(yàn)基本步驟提取細(xì)胞蛋白BCA定量制備蛋白膠（SDS-PAGE膠）蛋白樣品變性電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗TBST洗滌二抗TBST洗滌顯影結(jié)果分析試劑配制1.PBS磷酸鹽緩沖溶液1L磷酸二氫鉀 0.24g磷酸氫二鈉 1.44g氯化鈉 8g氯化鉀 0.2g加入500ml純水，調(diào)PH=7.2定容至1L,高壓蒸汽滅菌2.PBST（PBS+0.05%吐溫-20）500mlPBS+0.25ml吐溫-203.電轉(zhuǎn)液500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4冰箱預(yù)冷4.電泳液（1X）10x稀釋，50ml10x電泳液+450ml純水5.TBS6.TBST（TBS+0.05%吐溫

2、-20）50mlTBS+450ml純水+0.25ml吐溫-207.封閉液TBST1X+5%奶粉40ml封閉液=40mlTBST+2g奶粉，40預(yù)熱WB實(shí)驗(yàn)一、蛋白樣品制備準(zhǔn)備:一管細(xì)胞，PBS（4預(yù)冷），PMSF（100mM），移液槍（1000ul，10ul），1.5mlEP管2個(gè)，高速冷凍離心機(jī)4預(yù)冷1. 于-20冰箱中取出一管細(xì)胞樣品，吸去培養(yǎng)液2. 加入1ml 4預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。用移液槍輕輕吹成懸浮液后4，8000r離心5min，然后棄去上清。重復(fù)以上操作一次，共洗細(xì)胞兩次以洗去培養(yǎng)液。3.按1ml裂解液加10 l PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（

3、PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）4.在樣品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹勻，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。5.裂解完后，于4下12000 rpm離心5 min。7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于20保存。二、 蛋白含量的測(cè)定（BCA定量）準(zhǔn)備：96孔板，移液槍（1000ul，10ul，200ul），BCA工作液（A+B），50mlEP管，1xPBS，BSA標(biāo)準(zhǔn)液1. 將96孔板分好區(qū)域，若不夠分則只做兩個(gè)重復(fù)，（外圍一圈的孔最好不用）2. 算好孔數(shù)（總的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A液：B液=50:1，一般

4、配多些，如60孔，A液12000ul，B液240ul）3. 將樣品稀釋到一定倍數(shù)才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul樣品（2ul樣品+18ulPBS,即稀釋10倍），做三個(gè)重復(fù)則需要60ul，一般配80ul4. 配蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，將2mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.5mg/ml，若配200ul 的0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液則需要50ul的2mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和150ul PBS溶液5. 將稀釋好的樣品加入孔板中（標(biāo)記的區(qū)域），接著標(biāo)準(zhǔn)品按0，1,2,4,8,12,16,20ul加到標(biāo)號(hào)的區(qū)域，之后在加標(biāo)準(zhǔn)樣品的孔內(nèi)，將孔內(nèi)溶液用PBS補(bǔ)足到20ul6. 每孔加200u

5、l配好的工作液,平行加,不能上下加,以減少誤差7. 將加好的96孔板放在37下孵育30分鐘8. 孵育完后,放在酶標(biāo)儀輕微震蕩3-10s,中速,吸光值595nm,進(jìn)行比色測(cè)定,記錄標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品吸光值數(shù)據(jù)后,以蛋白含量（ml）為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（R2 >0.98才有用,酶標(biāo)儀操作:兩個(gè)箭頭圖標(biāo),1是結(jié)果,2是保存）9. 計(jì)算蛋白含量（注意定量樣品已經(jīng)稀釋了10倍）蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣量序號(hào)12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白量/ul （0.5mg/ml）01248121620背景液（PBS）/ul2019181612840標(biāo)準(zhǔn)液濃度mg/ml00.0250.050.10.20.30

6、.40.5三、SDSPAGE電泳 1.  配膠（12%,可以提前配好）準(zhǔn)備：玻璃板，梳子，AP（解凍，現(xiàn)拿現(xiàn)用），聚丙烯酰胺（4冰箱冷藏）（1）玻璃板驗(yàn)漏5min（2）按表配置分離膠（3）灌膠，加酒精封壓，凝30min（注意不要有氣泡）（4）按表配濃縮膠，倒掉酒精，用吸水紙吸去酒精，灌膠，插梳子（注意不要有氣泡），凝30min（5）取膠，用水沖洗一下濃縮膠，加少量水放入一次性手套中4冰箱保存?zhèn)溆?. 樣品處理準(zhǔn)備：PBS，移液槍，1.5mlEP管（1）稀釋樣品：一般每孔上樣5ul，即1mg/ml濃度的樣品，測(cè)完蛋白含量后，將樣品用PBS稀釋至1mg/ml（注意loading

7、buffer的加入也得算入）（2）取出上樣樣品15ul至1.5 ml離心管中，加入6×SDS 上樣緩沖液3ul至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過(guò)15 l，加樣孔的最大限度可加20 l樣品。）（3）將樣品在100煮5 min震蕩使蛋白完全變性（注意儀器操作）3.   電泳準(zhǔn)備：電泳液500ml（現(xiàn)配），蛋白膠，10ul移液槍（槍頭），樣品，Marker，冰盒，電泳裝置（1）將SDS-PAGE膠放入電泳槽中，加足夠的電泳液。（短玻璃板面向內(nèi)，長(zhǎng)玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的短玻璃板。注意先檢漏。）（2

8、） 上樣。用移液槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。）（3）先設(shè)置80V，開(kāi)始電泳，樣品溴酚藍(lán)跑至分離膠后增至120V電壓，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。（此時(shí)準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)液）四、轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備：電轉(zhuǎn)液（現(xiàn)配4冰箱冷藏），鑷子，濾紙，PVDF膜（0.45um），電轉(zhuǎn)裝置，冰盒注意：拿濾紙和膜時(shí)一定要戴手套或用鑷子，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。1.   在加有轉(zhuǎn)移液的盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊2. 濾紙浸入

9、電轉(zhuǎn)液中，PVDF膜在甲醇中潤(rùn)濕成半透明，小心將膜放入4電轉(zhuǎn)液中平衡至少5min。3.   將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。4. 先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上（做好標(biāo)記），用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊

10、，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門(mén)以使空氣流通。）5.  將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中（電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，漿槽放入冰中），要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。一般用100mA轉(zhuǎn)移90min。6.  轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。（準(zhǔn)備封閉液

11、）六、免疫反應(yīng)準(zhǔn)備：封閉液，一抗，二抗，TBST1 .  將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉2h。2.   TBST洗4次。每次5分鐘。3. 將膜按照目的蛋白所處位置剪切并做好標(biāo)記，加入相對(duì)應(yīng)的一抗，室溫孵育2h或者4過(guò)夜4. 室溫下孵育12 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5min5.  同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育12 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗4次，每次5 min七、顯影準(zhǔn)備：樣品膠片，移液槍（200ul），中槍頭，吸水紙，顯影液（A+B），薄鑷子一抗二抗目的蛋白78kdBip 1:1000兔二抗75kd目的蛋白34kdGAPDH內(nèi)參1:5000鼠二抗28kd目的