神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75NTR在不同胎齡人胎腦海馬中的表達(dá)

1、神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75NTR在不同胎齡人胎腦海馬中的表達(dá) 作者：王伴青，胡煜輝，廖義林，彭建安，溫永順【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)營養(yǎng)素受體；海馬；人胎腦【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)營養(yǎng)素受體；海馬；人胎腦 0引言神經(jīng)營養(yǎng)素是一個高度保守的生長因子家族,包括兩種受體: 低親和力的神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75 (p75 neurotrophin receptor, p75NTR)和高親和力的Trk. p75NTR是一種Mr為75 000的I型膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族（TNFR）的成員. 在不同的條件下p75NTR發(fā)揮完全不同的生物學(xué)效應(yīng)，一方面它與Trk共表達(dá)時，二者結(jié)合成雜合二聚體，形成神經(jīng)營養(yǎng)因子的高親和性受體，促

2、進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活與生長；另一方面，當(dāng)p75NTR單獨表達(dá)時，它能以相同的親和力與所有的神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡1-2. 海馬屬邊緣系統(tǒng)，與學(xué)習(xí)記憶、情緒、行為及內(nèi)臟活動密切相關(guān)，在胚胎海馬的發(fā)育過程中，神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡活動非常活躍. 我們通過研究p75NTR在胚胎海馬發(fā)育過程中的表達(dá)及其變化規(guī)律,探討了p75NTR對神經(jīng)元發(fā)育的影響.1 / 13 1材料和方法 1.1材料收集臨床水囊引產(chǎn)胎兒45例(性別不限), 按末次月經(jīng)時間結(jié)合測量頂臀長（Patten法3）推算胎齡，按胎齡分成1316 wk（n=10）、1720 wk（n=12）、2124 wk（n=9）、2528 wk（n

3、=8）、2932 wk（n=6） 5組. 每例水囊引產(chǎn)胎兒均無神經(jīng)系統(tǒng)畸形，其母親均查體健康，由井岡山學(xué)院附屬醫(yī)院和吉安市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)胎兒母親及家屬簽字同意后提供. 鼠抗人p75NTR mAb為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于北京中山生物試劑公司. 1.2方法 1.2.1取材、固定及切片水囊引產(chǎn)胎兒娩出后( 均已死亡) 23 h內(nèi)開胸經(jīng)左心室先以生理鹽水灌注沖洗干凈后,再以40 g/L多聚甲醛液/0.1 mol磷酸緩沖液灌注固定4 h, 打開頭皮及顱骨,撕除腦表面之被膜, 切取海馬組織,相同固定液后固定1 wk，經(jīng)7001000 mL/L上行梯度

4、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋, 連續(xù)切片，切片厚度為8 ,貼于涂有多聚賴氨酸膠的清潔玻璃片上烤干待用. 1.2.2免疫組化染色(法)采用mAb鏈菌素親生物蛋白過氧化物酶()免疫組化法. 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后, 清水沖洗，滴加30 g/L過氧化酶阻斷劑50 L,室溫30 min,清水沖洗; 0.01 mol/L S洗5 min×3次;加10 g/L正常山羊血清50 L,室溫下孵育30 min,吸去多余液體;5組分別滴加鼠抗人p75 mAb（1100）（Santa Cruz,USA） 50 L,4的冰箱過夜, 0.01 mol/L S洗5 min×3次；加生物素標(biāo)記二抗（12

5、00） 50 L,室溫下1 h， 0.01 mol/LS洗5 min×3次；加溶液50 L,室溫下1 h，0.01 mol/L S洗5 min×3次;加DAB液100 L,顯色5 min后雙蒸水沖洗中止反應(yīng),脫水、透明、中性樹脂封片,光鏡下觀察. 用0.01 mol/L S代替一抗作對照實驗，結(jié)果為陰性. 1.2.3圖像分析每組每例取3張切片，每張切片在光鏡(×400)下陽性細(xì)胞分布均勻的部位隨機(jī)各取510個視野,圖像經(jīng)攝像儀輸入電子計算機(jī),經(jīng)HMIAS2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)細(xì)胞測量程序處理,計算出每組陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，再計算出每組樣本的陽性細(xì)胞

6、百分率. 統(tǒng)計學(xué)處理: 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件中R×C表資料的2檢驗比較組間p75NTR陽性細(xì)胞百分率，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1p75NTR的表達(dá)與分布在光學(xué)顯微鏡下觀察p75NTR免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，部分胞核淡染. 在不同胎齡的切片均可見p75NTR免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞. 由于在16 wk前胎兒海馬內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞體積小而圓，細(xì)胞核大，胞質(zhì)少，p75NTR免疫反應(yīng)產(chǎn)物范圍小，部分結(jié)構(gòu)陽性細(xì)胞計數(shù)較困難. 在胚胎1316 wk，海馬CA1,CA2,CA3區(qū)錐體細(xì)胞層內(nèi)均可見分布著大量小而密集的強(qiáng)染或中等度染色的圓形p7

7、5NTR陽性細(xì)胞（圖1A），隨著胎齡的增加，細(xì)胞形態(tài)由小而圓逐漸變?yōu)殄F體形. 在緊靠錐體細(xì)胞層淺表面的輻射層內(nèi)也可見排列許多胞體較大、形態(tài)與錐體細(xì)胞類似、排列松散的p75NTR陽性細(xì)胞，并且呈現(xiàn)明顯的神經(jīng)氈染色（圖1B）. 17 wk之后的海馬齒狀回已清晰可辨，可見大量密集排列的陽性顆粒細(xì)胞，CA1,CA2及CA3區(qū)的陽性錐體細(xì)胞密度隨胎齡增長而逐漸降低，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，輻射層神經(jīng)氈染色強(qiáng)度減弱（圖1C）. 32 wk時，p75NTR陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，主要分布于齒狀回，在海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層深部及CA1/CA2交界處可見少量散在分布且染色較弱的大型錐體細(xì)胞，其余部位未見或僅見一些微弱

8、染色、輪廓模糊的陽性細(xì)胞，輻射層神經(jīng)氈染色消失(圖1D). 2.2各組p75陽性細(xì)胞率比較不同組別胎齡為1316, 1720, 2124, 2528, 2932 wk的人胚胎海馬p75NTR陽性細(xì)胞百分率(%)分別為43.2, 36.8, 25.7, 19.5, 14.3, 陽性細(xì)胞百分率隨胎齡的增加而呈現(xiàn)降低趨勢， 具有顯著性的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）. 3討論許多在體和體外實驗已經(jīng)證實4-6p75NTR的高表達(dá)會導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡（尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段），但也有研究表明p75NTR的缺失也會引起感覺神經(jīng)元數(shù)目的大量減少7-8. 還有實驗證實p75NTR有助于小腦神經(jīng)細(xì)

9、胞和感覺神經(jīng)Schwann細(xì)胞的遷移9-11. p75NTR對細(xì)胞的存活與死亡的作用及其機(jī)制目前仍不明確. A: 14 wk胎兒海馬CA1區(qū); B: 16 wk胎兒海馬CA1區(qū)輻射層; C: 19 wk胎兒海馬CA2區(qū); D: 32 wk胎兒海馬齒狀回. 圖1p75NTR的分布SP ×400 海馬是神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)源地之一，在胚胎發(fā)育過程中海馬神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化和凋亡活動非?；钴S12-13. 本實驗在各個發(fā)育階段的海馬切片中均檢測到p75NTR的免疫反應(yīng)陽性表達(dá)細(xì)胞，而且在分布部位和形態(tài)上存在差異；本研究表明，隨著胎齡的增加p75NTR陽性細(xì)胞表現(xiàn)出密度降低、數(shù)目減少的趨勢，與海馬神經(jīng)

10、細(xì)胞的總體發(fā)育進(jìn)程相吻合. 在1316 wk的人胚胎海馬中的p75NTR高表達(dá), 而在胎齡32 wk時海馬CA1, CA2和CA3等部位未見或僅見一些弱染色、輪廓模糊的大型p75NTR陽性錐體形細(xì)胞. 這種結(jié)果表明p75NTR主要在未分化和未成熟的神經(jīng)細(xì)胞中高表達(dá)，隨著海馬的發(fā)育這些細(xì)胞通過遷移和分化而分布于海馬各部；而在此過程中，留在發(fā)育較早的部位的神經(jīng)細(xì)胞的逐漸發(fā)育成熟或凋亡，p75NTR陽性細(xì)胞的密度和數(shù)目表現(xiàn)為顯著的下調(diào). 在胎齡32 wk時齒狀回仍存在一定數(shù)量的p75NTR陽性細(xì)胞，說明在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的后期甚至在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后齒狀回可能仍然存在神經(jīng)干細(xì)胞. 本研究表明p75NTR

11、主要在神經(jīng)細(xì)胞的早期發(fā)育過程中豐富表達(dá)，通過一些信號通路調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與分化.在神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)、增殖、遷移、分化、突觸的建立和神經(jīng)的形成、凋亡等一系列過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的生物學(xué)效應(yīng). 但其作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究. 【參考文獻(xiàn)】 1 Wang X,Bauer JB,Li Y,et al. Characterization of a p75NTR apoptotic signal-ing pathway using a novel cellular model J.J Biol Chem,2001,276(36):33812. 2 Yamashita T,Fujitani M,Hata K

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