生物技術(shù)制藥知識(shí)點(diǎn)總結(jié)(1)

1、生物技術(shù)制藥知識(shí)點(diǎn)綱要生物技術(shù)制藥:采用現(xiàn)代生物技術(shù)，借助某些微生物、植物、動(dòng)物生產(chǎn)藥品。生物技術(shù)藥物一般來說，采用DNA重組技術(shù)或其他生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。生物藥物：生物技術(shù)藥物是重組產(chǎn)品概念在醫(yī)藥領(lǐng)域的擴(kuò)大應(yīng)用，并與天然藥物.微生物藥物.海洋藥物和生物制品一起歸類為生物藥物。生物技術(shù)：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程、蛋白質(zhì)工程、抗體工程等?；蚬こ淌巧锛夹g(shù)的核心和關(guān)鍵，是主導(dǎo)技術(shù)；細(xì)胞工程是生物技術(shù)的基礎(chǔ)；酶工程是生物技術(shù)的條件；發(fā)酵工程是生物技術(shù)獲得最終產(chǎn)品的手段。生物技術(shù)：從廣義角度來看，是人類對(duì)生物資源（包括微生物、植物、動(dòng)物）的利用、改造并為人類服務(wù)

2、的技術(shù)。第三代生物技術(shù)是海洋生物技術(shù)我國科學(xué)家承擔(dān)了人類基因組計(jì)劃1%的測(cè)序工作現(xiàn)代生物技術(shù)包括:重組DNA技術(shù)細(xì)胞和原生質(zhì)體融合技術(shù)酶和細(xì)胞的固定化技術(shù)植物脫毒和快速繁殖技術(shù)動(dòng)物和植物細(xì)胞的大量培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)代生物反應(yīng)工程和分離工程技術(shù)蛋白質(zhì)工程技術(shù)海洋生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)主要體現(xiàn)在下列幾個(gè)方面：基因操作技術(shù)日新月異，不斷完善。新技術(shù)、新方法一經(jīng)產(chǎn)生便迅速地通過商業(yè)渠道出售專項(xiàng)技術(shù)，并在市場(chǎng)上加以應(yīng)用。基因工程藥物和疫苗的研究和開發(fā)突發(fā)猛進(jìn)。新的生物治療制劑的產(chǎn)業(yè)化前景十分光明，21世紀(jì)整個(gè)醫(yī)藥工業(yè)將面臨全面的更新改造。轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物取得重大突破現(xiàn)代

3、生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用將給農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來新的飛躍。闡明生物體基因組及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的一個(gè)主流方向，基因治療取得重大進(jìn)展，有可能革新整個(gè)疾病的預(yù)防和治療領(lǐng)域。蛋白質(zhì)工程是基因工程的發(fā)展，它將分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合起來，形成一門高度綜合的學(xué)科。信息技術(shù)的飛躍發(fā)展?jié)B透到生命科學(xué)領(lǐng)域中，形成形成引人注目、用途廣泛的生物信息學(xué)。生物技術(shù)藥物的特性是什么？生物技術(shù)藥物的特征是：（1）分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜（2）具有種屬差異特異性（3）治療針對(duì)性強(qiáng).療效高（4）穩(wěn)定性差（5）免疫原性（6）基因穩(wěn)定性（7）體內(nèi)半衰期短（8）受體效應(yīng)（9）多效應(yīng)和網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)（10）檢驗(yàn)

4、特殊性生物技術(shù)發(fā)展的不同階段的技術(shù)特征和代表產(chǎn)品（1）傳統(tǒng)生物技術(shù)的技術(shù)特征是釀造技術(shù)，所得產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，屬于微生物的初級(jí)代謝產(chǎn)物。代表產(chǎn)品如酒.醋.乙醇，乳酸，檸檬酸等。（2）近代生物技術(shù)階段的技術(shù)特征是微生物發(fā)酵技術(shù)，所得產(chǎn)品的類型多，不但有菌體的初級(jí)代謝產(chǎn)物.次級(jí)代謝產(chǎn)物，還有生物轉(zhuǎn)化和酶反應(yīng)等的產(chǎn)品，生產(chǎn)技術(shù)要求高.規(guī)模巨大，技術(shù)發(fā)展速度快。代表產(chǎn)品有青霉素，鏈霉素，紅霉素等抗生素，氨基酸，工業(yè)酶制劑等。（3）現(xiàn)代生物技術(shù)階段的技術(shù)特征是DNA重組技術(shù)。所得的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，治療針對(duì)性強(qiáng)，療效高，不足之處是穩(wěn)定性差，分離純化工藝更復(fù)雜。代表產(chǎn)品有胰島素，干擾素和疫苗等。新型生物反應(yīng)

5、器有:1.氣升式生物反應(yīng)器2.流化床式生物反應(yīng)器3.固定床式生物反應(yīng)器4.袋式或膜式生物反應(yīng)器5.中空纖維生物反應(yīng)器生物技術(shù)藥物分類1.重組DNA技術(shù)制造的多肽、蛋白類藥物2.基因藥物，包括基因治療藥、基因疫苗、反義藥物、核酶3.來自動(dòng)、植物、微生物的天然藥物4.合成與半合成的生物藥物按照醫(yī)學(xué)用途分類：1.治療藥物，治療疾病是生物藥物的主要功能。2.診斷藥物，具有速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。3.預(yù)防藥物，對(duì)于許多傳染性疾病來說，預(yù)防比治療更重要。生物技術(shù)藥物的特性1.分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜2.具有種屬特異性3.治療針對(duì)性強(qiáng)，療效高4.穩(wěn)定性差5.基因穩(wěn)定性6.免疫原性7.體內(nèi)t1/2短8.受體效應(yīng)

6、9.多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)10.檢驗(yàn)的特殊性生物技術(shù)制藥的特征1.高技術(shù)：高知識(shí)人才，高技術(shù)手段2.高投入：13億美元/藥3.長(zhǎng)周期：810年/藥4.高風(fēng)險(xiǎn)：成功率510%5.高收益：回報(bào)率10倍生物技術(shù)制藥分為哪些類型？生物技術(shù)制藥分為四大類：（1）應(yīng)用重組DNA技術(shù)(包 括基因工程技術(shù).蛋白質(zhì)工程技術(shù))制造的基因重組多肽，蛋白質(zhì)類治療劑。（2）基因藥物，如基因治療劑，基因疫苗，反義藥物和核酶等（3）來自動(dòng)物.植物和微生物的天然生物藥物（4）合成與部分合成的生物藥物生物技術(shù)在制藥中有那些應(yīng)用?答案：生物技術(shù)應(yīng)用于制藥工業(yè)可大量生產(chǎn)廉價(jià)的防治人類重大疾病及疑難癥的新型藥物，具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

7、（1）基因工程制藥，利用基因工程技術(shù)可生產(chǎn)出具有生理活性的肽類和蛋白質(zhì)類藥物，基因工程疫苗和抗體，還可建立更有效的藥物篩選模型，改良現(xiàn)有發(fā)酵菌種，改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提供更準(zhǔn)確的診斷技術(shù)和更有效的治療技術(shù)等。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用前景會(huì)更廣闊。（2）細(xì)胞工程和酶工程制藥該技術(shù)的發(fā)展為現(xiàn)代制藥技術(shù)提供了更強(qiáng)大的技術(shù)手段，使人類可控制或干預(yù)生物體初次生代謝產(chǎn)物和生物轉(zhuǎn)化等過程，使動(dòng)植物能更有效的滿足人類健康方面的需求。（3）發(fā)酵工程制藥發(fā)酵工程制藥的發(fā)展主要體現(xiàn)在對(duì)傳統(tǒng)工藝的改進(jìn)，新藥的研制和高效菌株的篩選和改造等。第一節(jié) 基因的概念與特性一、基因的概念:DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,

8、是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。二、基因的一般特性：基因可自我復(fù)制，基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，基因可突變。 基因按功能分為：結(jié)構(gòu)基因 調(diào)控基因三、DNA的結(jié)構(gòu)與性能DNA的結(jié)構(gòu)：四種核苷酸（A T C G）連接一級(jí)結(jié)構(gòu)、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)（，），雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA的性質(zhì)與功能:吸收光譜260電場(chǎng)中泳動(dòng)變性、復(fù)性、雜交第二節(jié) DNA的復(fù)制與表達(dá)二、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板合成mRNA的過程。2.翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運(yùn)載工具,將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質(zhì)的過程。(1)分為三個(gè)階段：起始延長(zhǎng)終止(2)翻譯后的肽鏈加工:羥基化糖基化磷酸化乙?；诙?基因工程制藥第一節(jié)

9、 概 述醫(yī)用活性蛋白和多肽類包括：免役性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體。細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子及凝血因子。激素，如胰島素、生長(zhǎng)激素、心鈉素。酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑及超氧化物岐化酶等?；蚬こ碳夹g(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)1.利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等），為臨床使用建立有效的保障。2.可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍。3.利用基因工程可以發(fā)現(xiàn)挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。4.內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用

10、時(shí)，存在不足之處，可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造。5.利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。第二節(jié) 基因工程藥物生產(chǎn)的過程基因工程技術(shù)是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌 (或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。基因工程藥物：系指先確定對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成過程的基因分離、純化或進(jìn)行人工合成，利用重組DNA技術(shù)加以改造，最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞中不斷繁殖，并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過這種方法生產(chǎn)的新型藥物稱為基因工程藥物。基因工

11、程藥物制藥的主要程序（步驟）目的基因的克隆構(gòu)建DAN重組體DAN重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌工程菌發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)品的檢驗(yàn)等基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞）培養(yǎng)工程菌 產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝基因工程的單元操作順序是酶切，連接，轉(zhuǎn)化，篩選，驗(yàn)證 闡述基因工程藥物研制有那些主要過程？答案：（1）基因工程藥物的生產(chǎn)必須首先獲得目的基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將所需目的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌或其他宿主菌（細(xì)胞），以便大量復(fù)制目的基因。對(duì)目的基因要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和核苷酸序列分析。（2）目的基因獲得后，

12、最重要的就是使目的基因表達(dá)?；虻谋磉_(dá)系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物化的難易。將目的基因與表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)入合適表達(dá)系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的基因工程菌（細(xì)胞）。（3）建立適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，以便獲得較高產(chǎn)量的目的基因表達(dá)產(chǎn)物。（4）建立起一系列相應(yīng)的分離純化、質(zhì)量控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)。第三節(jié) 目的基因的獲得克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。1、 逆轉(zhuǎn)錄法 ：逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的 mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后進(jìn)行 cDNA 的克隆表達(dá)。 mRNA的純化 cDNA第一鏈的合成 cDNA第二鏈的合成 cDNA的克隆 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞： cDNA文庫的鑒定：

13、抗性基因失活法、噬菌斑顏色改變法 目的cDNA克隆的分離和鑒定：核酸探針雜交法、免疫反應(yīng)鑒定法三、化學(xué)合成法 ：較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。再按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的核甘酸序列。用化學(xué)法合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火使連接成較長(zhǎng)的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。人工化學(xué)合成基因的限制有： 不能合成太長(zhǎng)的基因 目前 DNA 合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為 5060 bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。遺傳

14、密碼的簡(jiǎn)并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測(cè)核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。費(fèi)用高。四、基因篩選的新方法1.編碼序列富集法2.島嶼獲救PCR法3.動(dòng)物雜交法4.功能克隆法5.構(gòu)建cDNA文庫6.差異顯示技術(shù)的應(yīng)用五、對(duì)已發(fā)現(xiàn)基因的改造應(yīng)用基因修飾技術(shù)和點(diǎn)突變技術(shù)提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、t1/2、提高表達(dá)量，降低毒性或免疫原性。第四節(jié) 基因表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程?；蚋咝П磉_(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。最佳的基因表達(dá)體

15、系：;目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高;表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定;生物活性高和表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化一、宿主細(xì)胞的選擇適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求:1.容易獲得較高濃度的細(xì)胞；2.能利用易得廉價(jià)原料；3.不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；4.發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；5容易進(jìn)行代謝調(diào)控；6.容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作；7.產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化。宿主細(xì)胞分為兩大類：第一類為原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。二、大腸桿菌中的基因表達(dá)載體 ：是基因工程的目的和基本手段，是選用合適的載體把供體DNA（外源基因）運(yùn)載到受體細(xì)

16、胞內(nèi)，從而復(fù)制擴(kuò)增大量的目的DNA分子或轉(zhuǎn)錄表達(dá)為相應(yīng)的產(chǎn)物?；蚬こ梯d體分為：克隆載體,轉(zhuǎn)錄載體,表達(dá)載體;DNA(克隆載體）DNA(轉(zhuǎn)錄載體）RNA蛋白質(zhì)（表達(dá)載體）原核細(xì)胞的基因組特點(diǎn)：染色質(zhì)為環(huán)狀雙股DNA分子 具有操縱子結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝 特定區(qū)域分布特異DNA順序，因此外源DNA分子可以插入原核細(xì)胞DNA復(fù)制體系的特定區(qū)段基因克隆載體1）定義：基因克隆載體是一類能夠承載外源基因并將其帶入受體細(xì)胞得以穩(wěn)定維持的DNA分子。2）目前經(jīng)常使用的載體，有質(zhì)粒和病毒兩類。各種不同的載體，盡管分子量大小、結(jié)構(gòu)和用途上存在著較大的差異，但是作為載體，它們應(yīng)該具備一些共同的特性?；蚬こ炭寺?/p>

17、載體的特點(diǎn)：具有復(fù)制子有單一限制內(nèi)切酶切位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)有選擇性遺傳標(biāo)記如抗藥基因拷貝數(shù)高生物安全性好質(zhì)粒的分類按復(fù)制型式嚴(yán)緊型 松弛型按基因轉(zhuǎn)移性傳遞性質(zhì)粒 非傳遞性質(zhì)粒按遺傳性狀產(chǎn)物分類:抗生素抗性限制酶、修飾酶系統(tǒng)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)載體必須具備條件載體能夠獨(dú)立復(fù)制。載體本身是一個(gè)復(fù)制子，具有復(fù)制起點(diǎn)。應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識(shí)別。應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)AU

18、G和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯?；蚬こ趟幬镅兄朴心切┲饕^程？（1）基因工程藥物的生產(chǎn)必須首先獲得目的基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將所需目的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌或其他宿主菌（細(xì)胞），以便大量復(fù)制目的基因。對(duì)目的基因要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和核苷酸序列分析。（2）目的基因獲得后，最重要的就是使目的基因表達(dá)?；虻谋磉_(dá)系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物化的難易。將目的基因與表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)入合適表達(dá)系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的基因工程菌（細(xì)胞）。（3）建立適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，以便獲得較高產(chǎn)量的目的基因表達(dá)產(chǎn)物。（4）建立起一系列相應(yīng)的分離純化、質(zhì)量控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)

19、。 影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)：外源基因是克隆到載體上的，因此載體在宿主菌種的拷貝數(shù)就直接關(guān)系到外源基因的拷貝數(shù)。外源基因的表達(dá)效率啟動(dòng)子的強(qiáng)弱核糖體接合位點(diǎn)的有效性SD序列和起始密碼ATG的間距密碼子組成表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；利用大腸桿菌的信號(hào)肽或某些真核多肽中自身的信號(hào)肽，把真核基因產(chǎn)物搬動(dòng)到胞漿周質(zhì)的空隙中；采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；采用蛋白酶缺陷型大腸桿菌，有可能減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。細(xì)胞代謝負(fù)荷：工程菌的培養(yǎng)條件：外源基因的高水平表達(dá)，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關(guān)系，而

20、且與其所處的環(huán)境條件息息相關(guān)，必須優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高基因表達(dá)水平。表達(dá)用的酵母菌應(yīng)滿足哪些條件？答：表達(dá)用的酵母宿主菌應(yīng)具備菌體生長(zhǎng)力強(qiáng).菌體內(nèi)蛋白酶要較弱.菌株性能穩(wěn)定. 分泌能力強(qiáng)?；蚬こ趟拗骶鷳?yīng)滿足那些要求？目前應(yīng)用最廣泛的宿主菌有哪些？（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞；（2）能利用廉價(jià)易得的原料；（3）不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；（4）發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；（5）容易進(jìn)行代謝調(diào)控；（6）容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作；（7）產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取。宿主菌可分兩大類：1）原核細(xì)胞：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌；2）真核細(xì)胞：酵母菌、絲狀真菌、哺乳動(dòng)

21、物細(xì)胞。表達(dá)載體須具備哪些條件？常用載體有哪些？（1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。（2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，但每種切口最好只有1個(gè)，以便與外源基因連接。（3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（4）所產(chǎn)生的mRNA必須有翻譯的起始信號(hào)。（5）具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子。（6）有很強(qiáng)的終止子。（7）常用載體有：1、細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒。2、噬菌體載體。第五節(jié) 基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)一、菌體的生長(zhǎng)與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長(zhǎng)。提高pH，可減少乙酸的抑制作用。分批培養(yǎng)

22、中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長(zhǎng)，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入甲硫氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長(zhǎng)速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷?xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長(zhǎng)率提高，蛋白合成增加。基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長(zhǎng)速率降低。質(zhì)粒存在對(duì)菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。如：三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶

23、、天冬氨酸轉(zhuǎn)酰基酶等。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長(zhǎng)速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)?！皣?yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí),核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點(diǎn)的ppGpp的結(jié)果。第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性質(zhì)粒不穩(wěn)定 基因工程菌在傳代（25代以上）過程中常出現(xiàn)的現(xiàn)象。分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變常見分裂不穩(wěn)定的兩個(gè)因素：含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率（質(zhì)粒丟失率）；這兩種菌（含質(zhì)粒菌和不含質(zhì)粒菌）比生長(zhǎng)速率差異的大小。二、

24、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1.合適的宿主：宿主菌2.合適的載體:質(zhì)?？截悢?shù)3.選擇壓力：抗生素4.分階段控制培養(yǎng)：先使菌體生長(zhǎng)至一定密度； 再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)5.控制培養(yǎng)條件：溫度、pH值、培養(yǎng)基組分、溶氧6.固定化：卡拉膠第八節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng)一、基因工程菌的培養(yǎng)方式：1分批培養(yǎng)；2補(bǔ)料分批培養(yǎng)；3連續(xù)培養(yǎng)；4透析培養(yǎng)；5固定化培養(yǎng)2. 補(bǔ)料分批培養(yǎng) 是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過一段時(shí)間后間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基（溶氧控制、流加補(bǔ)料），使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的方法。良好的生長(zhǎng)環(huán)境，延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得高密度菌體。對(duì)發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素有：培養(yǎng)基的影響接種量的影響溫度的影響溶解氧的影響誘

25、導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響7.pH的影響接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。最佳化的工藝是獲得（七最）:最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果和最低失敗率。第九節(jié) 高密度發(fā)酵高密度發(fā)酵：培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50g DCW/L（細(xì)胞干重/L）以上，最高200g DCW/L高密度發(fā)酵特點(diǎn) ：菌體高密度，總表達(dá)量高；生物反應(yīng)器體積??；單位體積生產(chǎn)能力高；生產(chǎn)周期短，分離成本小基因工程菌的高密度發(fā)酵過程中，目前普遍采用（ ）作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。影響高密度發(fā)酵的因素1.培養(yǎng)基：C源、N源種類和含量；C:N含量比值；微量元素；無機(jī)鹽（磷影響表達(dá)質(zhì)粒的

26、復(fù)制速率）2.溶氧濃度：空氣分離系統(tǒng)提高氧分壓；透明顫菌血紅蛋白基因克隆到菌體中，提高氧傳質(zhì)能力；菌體與小球藻混合培養(yǎng)，藻細(xì)胞光合作用產(chǎn)氧供菌體呼吸。3.pH值：大腸桿菌產(chǎn)酸、CO2必須加堿調(diào)節(jié)pH值4.溫度：控制菌體生長(zhǎng)，溫控誘導(dǎo)表達(dá)（誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2min）5.代謝副產(chǎn)物： C源物質(zhì)供應(yīng)超過三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈能力，產(chǎn)生乙酸，抑制菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。采取流加補(bǔ)料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。二、實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法1.發(fā)酵條件的改進(jìn)（1）培養(yǎng)基的選擇：（2）建立流加式培養(yǎng)方式；（3）提高供氧能力2.構(gòu)建產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻斷乙酸生產(chǎn)的主要途徑：（

27、2）對(duì)碳代謝流進(jìn)行分流：（3）限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流；（4）引入血紅蛋白基因。3.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵有什么不同？簡(jiǎn)單分析其溫度對(duì)發(fā)酵的影響。第十節(jié)基因工程藥物的分離純化離子交換層析：是依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。疏水層析：是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域和固定相上疏水基團(tuán)之間的相互作用力差異，對(duì)蛋白組分進(jìn)行分離的層析方法。疏水層析的基本原理？蛋白質(zhì)表面多由親水基團(tuán)組成，也有一些疏水性較強(qiáng)的疏水區(qū)。 在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)表面疏水部位的水化層被破壞，暴露出疏水部位，疏水作用增強(qiáng)，與固定相上的疏水基團(tuán)產(chǎn)生疏水性作用而被吸附；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來。親和層析的基本原理？通過將具有親和力的兩個(gè)分子