乙肝表面抗原定量測定的方法學(xué)驗(yàn)證分析

1、CHENGDU MEDICAL COLLEGE乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證姓名Z P學(xué)號(hào)0925400072班級(jí)09級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科二班指導(dǎo)老師沈富兵二一三年四月乙肝表面抗原定量測定的方法學(xué)驗(yàn)證作者：ZP (成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院09級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科二班，610500)【摘要】目的用福州藍(lán)圖生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒對乙肝表面抗原定量測定的方法進(jìn)行驗(yàn)證，以判斷是否能用于教學(xué)以及臨床分析。方法 運(yùn)用ELLISA法定量測定乙肝表面抗原，應(yīng)用試劑盒 HBsAg標(biāo)準(zhǔn)從濃度為8ng/ml的2倍稀釋的6個(gè)濃度梯度，根據(jù) OD值繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線再計(jì)算相對回收率和板內(nèi)

2、和板間精密度，通過資料數(shù)據(jù)綜合分析。結(jié)果 HBsAg線性較好，其準(zhǔn)確度、精密度、LOD值均在正常范內(nèi)。 結(jié)論 ELISA法定量檢測HBsAg能較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù) 制情況，可以用于教學(xué)以及臨床分析?！娟P(guān)鍵詞】乙肝表面抗原方法學(xué)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密度 ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害較大，我國是病毒性乙型肝炎的高發(fā)流行區(qū)， 普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV感染率接近60%，約占世界 HBV!帶者的1/3。乙型肝炎病毒的病原體不僅具有傳染性，還可能導(dǎo)致發(fā)展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、準(zhǔn)確、定量檢測對乙型肝炎臨床診 斷、療效觀察及預(yù)防

3、具有重要的意義。酶免分析法HBV- EIA是 HBVS原和抗體最常用的檢測技術(shù)，其方法簡便、價(jià)廉，適合一般實(shí)驗(yàn)室推廣，其中酶聯(lián)免疫吸附 技術(shù)(en zyme lin ked immuno sorbe nt assay, ELISA)目前應(yīng)用最為廣泛，它常用聚苯乙烯為固相載體，使其與待測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，然后加酶標(biāo)記的抗原或抗體，再加底物顯色，最后根據(jù)色澤深淺來推算待測抗原或抗體的含量。 此方法特異性高，有效測定范圍可達(dá)到 20500 ng/ml，且酶免疫法有標(biāo)記的試劑 比較穩(wěn)定并且無放射線危害等優(yōu)點(diǎn)。我們采用對已知抗體濃度的樣品進(jìn)行 ELISA的定量檢測，通過對其數(shù)據(jù)的分 析來驗(yàn)證E

4、LISA法最乙肝表面抗原定量檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，以衡量其實(shí)用性。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍(lán)圖生物工程有限公司出品。 1.1.2儀器及酶標(biāo)板酶標(biāo)儀：Bio-Rad 680;洗板機(jī)：Bio-Rad 1575;超純水系統(tǒng)：Millipore Elix ； 電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052):上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。1.1.3溶液配制0.01M pH7.4的PBS緩沖液：稱取 8g NaCI、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4,溶于 800ml 蒸 餾水中，用HCI調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,最后加蒸餾水

5、定容至1L即可。質(zhì)控品：用PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品配制成6、3、1.5ng/ml三個(gè)質(zhì)控品，每質(zhì)控品1ml。首先取450 d的8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品到C1號(hào)EP管中再向其中加入150 d的PBS緩 沖液，即配制成了 6ng/ml的質(zhì)控品，再取300pl C1號(hào)EP管內(nèi)的溶液到C2號(hào) EP管內(nèi)，再向C2號(hào)管內(nèi)加入300 pl的緩沖液混勻。即配制成了 3ng/ml的質(zhì)控 品。接著取300 d C2號(hào)管內(nèi)的液體到C3號(hào)EP管內(nèi)，再加入300 d的緩沖液混 勻，即配制成了 1.5ng/ml的質(zhì)控品。具體方法如下圖11.2檢測方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度的配制用PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品配制成 8、4、2、1、0.

6、5、0.25ng/ml。先取6個(gè)EP管分別標(biāo)記為對應(yīng)的濃度。取400 d標(biāo)準(zhǔn)品于標(biāo)記為的EP管中，再取200 d號(hào)管內(nèi)液體于 號(hào)管內(nèi)再向 號(hào)管中加入200d的緩沖液混勻，即配制成了濃度為 4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。再從 號(hào)管內(nèi)取200 d的液體到 號(hào)管內(nèi)，接著取200 d的緩沖液到 號(hào) 管內(nèi)混勻，即配制成了 2ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。從 號(hào)管內(nèi)取200 d的標(biāo)準(zhǔn)品到號(hào)管內(nèi)，再向號(hào)管內(nèi)加入200 d的緩沖液混勻，即配制成了 1ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。用同樣的方法，配制好濃度分別為0.5ng/ml、0.25ng/ml.的標(biāo)準(zhǔn)品體積分別為200d、200d、400pl備用。具體方法如下圖 2圖21.2.2測定方

7、法取出試劑盒中已包被酶標(biāo)板，取出板條，在相應(yīng)孔中加入已配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白對照；88631.5O44631.5O22631.5O11631.5O0.50.5631.5O0.250.25OOOOOOOOO圖3注：雙線框區(qū)域?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品，濃度依次為8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三線框區(qū)域?yàn)橘|(zhì)控品，濃度依次為 6、3、1.5ng/ml，粗框區(qū)域?yàn)榭瞻讓φ占尤氲氖?PBS緩沖液，每個(gè)孔內(nèi)加入的均是 50 pl。37T溫育30min,洗板4次；加入酶標(biāo)抗體，生物素二抗，50孔；37T溫育30min,洗板4次；加入A、B液，50孔，37C溫育15分鐘；加入終止液，50孔。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲

8、線制作及結(jié)果計(jì)算酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，蓋上蓋子；在電腦上打開 Microplate Manager 5.2軟件；選擇450nm波長（參照波長630nm）,設(shè)置LAYOUT和報(bào)告模式，測定 各孔吸收值；輸入標(biāo)準(zhǔn)品各濃度值，以雙對數(shù)法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取各孔的濃度值，打 印標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和計(jì)算結(jié)果。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Microsoft Excel處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1測得的OD值如下表1.73901.63801.08500.69200.33800.01500.88400.88801.21700.67400.35300.00900.53600.50901.21800.65600.33800.01000.2

9、7200.26001.23300.67400.34700.00900.14900.13801.24800.69600.34300.01200.06200.07100.00900.01200.00200.00900.00900.01100.00900.01100.0100圖4注：圖4與圖3相對應(yīng)2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線1=濃度(ng/ml)圖5由上圖可得出如下結(jié)論：標(biāo)準(zhǔn)曲線以濃度為橫坐標(biāo)，以測得的0D值為縱坐標(biāo)。由對應(yīng)濃度和0D值 得出的散點(diǎn)連成一條直線后，散點(diǎn)基本都在直線上，說明散點(diǎn)的線性非常好。在 以后檢測乙肝表面抗原濃度的時(shí)候可以根據(jù)測出的0D值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的濃度。2.3準(zhǔn)確度（回收率）計(jì)算

10、各質(zhì)控品高中低三個(gè)濃度平均回收率分別為92.59%、100.887%、93.68%都在正常范圍內(nèi)如表1所示。ELISA法檢測 VEGFR2-F(的回收率準(zhǔn)確度(回收 率)計(jì)算VEGFR2-FC(n g/ml)測定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR(%)SD(%)64.99883.365.63793.9565.64294.03392.595.3065.71595.2565.78796.4533.093103.133.005100.16732.91897.267100.8872.6033.005100.16733.112103.7331.51.37791.81.51.45096.6671.

11、51.37791.893.682.071.51.42194.7331.51.40193.4表12.4精密度計(jì)算2.4.1板內(nèi)精密度板內(nèi)精密度質(zhì)控品各濃度組的 RSD都小于15%,精密度良好，如表2所示板內(nèi)精密度VEGFR2-FC測定值測定值測定值測定值測定值RSD(%)(ng/ml)12345本S64.9985.6375.6425.7155.7875.694 ±.3185.58533.0933.0052.9183.0053.1123.027 ± 0.0782.5771.51.3771.4501.3771.4211.4011.405 ± 0.0312.210表22.

12、4.2板間精密度板間各組濃度質(zhì)控品RSD都小于15%，說明板間精密度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。如表 3 所示。板間精密度VEGFR2-FC(ng/ml)測定值測定值測定值測定值測定值X _ SRSD(%)64.9985.6375.6425.7155.7875.694 ±.3185.58565.4715.4235.6745.3235.7465.5274 ± 0.1773.20265.7735.6745.7825.5475.6675.689 ± 0.0961.68733.0933.0052.9183.0053.1123.027 ± 0.0782.57732.8153.335

13、3.1873.2212.9333.098 ± 0.2166.97232.8863.3443.1183.2342.9973.116± 0.1825.8411.51.3771.4501.3771.4211.4011.405 ± 0.0312.2101.51.2261.2571.2271.5641.3341.322 ± 0.14210.7411.51.6651.2431.2361.5411.3201.401 ± 0.19213.704表32.5檢測限（LOD）計(jì)算：取空白孔的0D值的均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差?？瞻卓椎?D值的均數(shù)=0.0098空白孔的OD值的

14、標(biāo)準(zhǔn)差=0.0028L0D=0.0098+2*0.0028=0.01543討論通過圖4、圖5和表1、表2、表3可知本次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度、板內(nèi)精密度、 板間精密度、LOD值都復(fù)合實(shí)際，且各數(shù)據(jù)都趨于理想，對此我們做出分析：HBsAg是乙肝病毒感染后最早出現(xiàn)的血清標(biāo)志物之一，因此HBsAg的檢測是診斷肝炎病毒感染的重要依據(jù)。而針對這項(xiàng)檢測的檢測方法的靈敏度與高特異性 的高低以及二者的結(jié)合程度是影響檢驗(yàn)結(jié)果的重要因素，直接關(guān)系到臨床診斷和用藥，所以對HBsAg的檢測方法的建立和方法的驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵所在。本實(shí)驗(yàn)以HBsAg測定為例，為了對乙肝表面抗原ELISA法定量進(jìn)行分析的 方法學(xué)建立與驗(yàn)證，以確

15、認(rèn)ELISA法定量檢測HBsAg能否較準(zhǔn)確、快速地反映 體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況。按試劑說明書嚴(yán)格操作的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)用的試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA ）。往預(yù)先包被人乙肝病毒 表面抗原（HBsAg）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的 催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣品中的 人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光 度（0D值），計(jì)算樣品濃度。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑說明書操作的同時(shí)運(yùn)用計(jì)算機(jī) 軟件和酶標(biāo)儀，測得了

16、 0D值且繪制出了標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），通過倍比稀釋來完成其定量檢測。其中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度依次為：8 4、2、1、0.5、0.25ng/ml，每個(gè)濃度設(shè)置兩個(gè)孔，共十二個(gè)孔；質(zhì)控品的濃度依次為：6、3、1.5ng/ml，每個(gè)濃度設(shè)置五個(gè)孔，共十五個(gè)孔。往標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，而陰性對照加入等量 PBS,經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物 TMB 顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的 黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算質(zhì)控品的準(zhǔn)確度、 板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值。本

17、實(shí)驗(yàn)是設(shè)計(jì)精密，操作簡便、快捷。主要是通過對質(zhì)控品的準(zhǔn)確度、板內(nèi) 精密度、板間精密度、LOD值的計(jì)算和根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的 OD值得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 以確認(rèn)ELISA法定量檢測HBsAg能否較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情 況。如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9985,接近于1，即相關(guān)性良好。方法 準(zhǔn)確度（accuracy），一般用相對回收率表示，表明用該方法測得的生物樣品中待 測藥物的濃度與其真實(shí)濃度的接近程度，由表1可得出相對回收率符合參考值85%115%，所以該測定方法比較準(zhǔn)確。方法精密度（precision），般用RSD表示，對于ng/ml級(jí)水平的RSD 一般 應(yīng)W1%。由表2板內(nèi)精密度和

18、表3板間精密度可知，板內(nèi)精密度完全符合要求， 板間精密度基本符合要求。檢測限LOD，又稱方法的靈敏度，由計(jì)算得LOD=0.0154，說明本分析方法 對于低濃度樣品的檢測靈敏度高。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國人群乙型病毒肝炎感染率達(dá) 10%左右，乙肝的實(shí)驗(yàn) 診斷對于其治療及預(yù)防有重要參考意義。ELLISA適用于乙肝表面抗原的定量測 定，其優(yōu)點(diǎn)是快速、方便、操作簡單，且靈敏度相對于其他方法較高，自20世紀(jì) 70年代以來，許多高靈敏度的測定方法應(yīng)用于臨床免疫學(xué)檢測，特別是酶聯(lián)免疫法（ELLISA法）應(yīng)用最廣，其解決了低濃度HBsAg的定量檢測問題,能夠及時(shí) 有效的測定出乙肝表面抗原含量，對臨床診斷和用藥提供有力的依據(jù)。綜上所述，通過實(shí)驗(yàn)對HBsAg的準(zhǔn)確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、 LOD 值的評(píng)價(jià)和分析，證實(shí)該定量檢測方法，具有高靈敏度和高特異性，能夠滿足臨 床檢測和教學(xué)的要求。參考文獻(xiàn)1 李金明，王露楠，徐錫霞，等室內(nèi)質(zhì)量控制對乙型肝炎表面抗原準(zhǔn)確的影響J 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2001，24(4) : 255 2 施紀(jì)文，徐簡華，溫惠萍.ELISA法和膠體金免疫層析法檢測乙肝表面抗原的比較J.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，20 (5): 49.3 章敏，萬唐，彭慧中，等前S2、前S1