細(xì)胞培養(yǎng)流程

1、.螅羃芅蕿袈裊膁薈薇肁肇薇蝕襖莆薆螂聿芁蚅襖袂膇蚄薄肇肅蚄蚆袀莂蚃袈肆莈螞羈罿芄蟻蝕膄膀羋螃羇肆芇裊膂蒞芆薅羅芁蒞蚇膁膇莄蝿羃肅莃羂螆蒁莂蟻肂莇莂螄裊芃莁袆肀腿莀薆袃肅荿蚈肈莄蒈螀袁芀蕆袃肇膆蒆螞衿膂蒆螄膅肈蒅袇羈莆蒄薆膃節(jié)蒃蠆羆膈薂螁膁肄薁袃羄莃薀薃螇艿薀螅羃芅蕿袈裊膁薈薇肁肇薇蝕襖莆薆螂聿芁蚅襖袂膇蚄薄肇肅蚄蚆袀莂蚃袈肆莈螞羈罿芄蟻蝕膄膀羋螃羇肆芇裊膂蒞芆薅羅芁蒞蚇膁膇莄蝿羃肅莃羂螆蒁莂蟻肂莇莂螄裊芃莁袆肀腿莀薆袃肅荿蚈肈莄蒈螀袁芀蕆袃肇膆蒆螞衿膂蒆螄膅肈蒅袇羈莆蒄薆膃節(jié)蒃蠆羆膈薂螁膁肄薁袃羄莃薀薃螇艿薀螅羃芅蕿袈裊膁薈薇肁肇薇蝕襖莆薆螂聿芁蚅襖袂膇蚄薄肇肅蚄蚆袀莂蚃袈肆莈螞羈罿芄蟻蝕膄膀

2、羋螃羇肆芇裊膂蒞芆薅羅芁蒞蚇膁膇莄蝿羃肅莃羂螆蒁莂蟻肂莇莂螄裊芃莁袆肀腿莀薆袃肅荿蚈肈莄蒈螀袁芀蕆袃肇膆蒆螞衿膂蒆螄膅肈蒅袇羈莆蒄薆膃節(jié)蒃蠆羆膈薂螁膁肄薁袃羄莃薀薃螇艿薀螅羃芅蕿袈裊膁薈薇肁肇薇蝕襖莆薆螂聿芁蚅襖袂膇蚄薄肇肅蚄蚆袀莂蚃袈肆莈 細(xì)胞培養(yǎng)流程玻璃器皿清洗流程1. 生理鹽水瓶等清水沖洗、浸泡后除去標(biāo)簽2. 清水涮洗3. 洗潔精/洗衣粉水浸泡過夜（>16-18h）4. 清水涮洗(>10次)5. 泡酸過夜（>16-18h）6. 清水涮洗(>10次)后，流水沖洗過夜（>16-18h）7. 涮單蒸水三次8. 50-6024 h烤干后，鋁薄紙、牛皮紙封閉瓶口，鋪巾

3、包裹9. 120，100kPa高壓20min， 50-60 24 h烤干備用（2周內(nèi)）常用溶液配制 DMEM溶液的配制1 制備新鮮三蒸水。過濾器裝好0.22m濾膜，用三蒸水濕潤，120，100kPa高壓20分鐘。2將一包DMEM培養(yǎng)基干粉倒入燒杯，用三蒸水洗包裝袋內(nèi)面2-3次，倒入培養(yǎng)液中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液。磁力攪拌（1-2h）使之完全溶解。3 根據(jù)包裝袋上的要求補(bǔ)加所需量的碳酸氫鈉（0.02g）；根據(jù)實驗需要，添HEPES（5-20mmol/L）、谷氨酰胺和其他特殊物質(zhì)。4加入100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素。5必要時用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)

4、pH。加水定容至1L。pH 7.2-7.4。6 負(fù)壓泵連接過濾器過濾除菌，分裝于無菌100ml生理鹽水瓶中（90ml/瓶），20凍存。配制好的培養(yǎng)液使用時，37復(fù)溫，根據(jù)需要加入血清（5%-20%）培養(yǎng)細(xì)胞。HEPES(260.3) 15mMHEPES 3.905gDistilled water 1000ml(或直接加入1L培養(yǎng)基中)常用平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）配制方法(g/L)RingerPBSHanksD-HanksDulbeccoCaCl20.25-0.14-KCl 0.420.20.40.20.2KH2PO4-0.20.060.20.2MgCl

5、·6H2O-0.10-MgSO4·7H2O-0.10-NaCl 9.08.08.08.08.0NaHCO3-0.35-Na2HPO4·2H2O(269)-1.560.092.162.16NaH2PO4·2H2O-D-glucose-1.0-酚紅-0.010.02-消化液配制0.25%Trypsin+0.02%EDTA(pH8.0 , 37)Trypsin (1:250) 0.25g EDTA 0.02g D-hanks(Ca2+/Mg2+ free) 100ml 0.22m濾膜過濾除菌后分裝于高壓滅菌過的小青瓶中。-20凍存。Cryopreservati

6、on solution(凍存液)DMSO（二甲基亞砜）/甘油（高壓滅菌） 1ml（10）胎牛血清 2ml（20）培養(yǎng)液 7ml（70）原代細(xì)胞培養(yǎng)骨髓細(xì)胞培養(yǎng)1、 高壓手術(shù)器械及玻璃器皿：小彎剪（2）、小彎鑷（2）、皮鑷（1）、過濾網(wǎng)、離心管（4）、吸管（4）、小圓試管（4）、平皿（2）2、 方法器械盒等放入超凈臺，紫外燈消毒30分鐘酒精燈燒試管、離心管等備用，平皿中加入L-DMEM10FCS處死或過量麻醉實驗動物，浸泡于75酒精5分鐘小心分離取雙側(cè)股骨，勿破壞骨髓腔，放入平皿中，剝離其他組織移入另一平皿，放入超凈臺，從中間剪斷股骨，5ml注射器反復(fù)抽吸、吹洗經(jīng)濾網(wǎng)過濾去除組織塊，移入離心管8

7、00-1000轉(zhuǎn)/分離心，3-5分鐘，2次加培養(yǎng)基緩力吹打混勻細(xì)胞后，移至50ml培養(yǎng)瓶，37，5CO2培養(yǎng)MSC一般2天后換液，腫瘤細(xì)胞24h后換液細(xì)胞傳代細(xì)胞長滿80瓶壁后，消化傳代1、 吸除原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基洗一次。2、 瓶內(nèi)加入0.25trypsin0.02EDTA消化液（原代因細(xì)胞成分較雜，加EDTA較容易消化下來，傳代后的細(xì)胞一般只用trypsin消化即可），平搖培養(yǎng)瓶，使消化液流過細(xì)胞表面，373-5分鐘，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大后，即可吸出消化液，移至離心管，加血清終止消化。3、 加了EDTA消化的細(xì)胞800r離心兩次，3-5分/次，吸除上清。如

8、果只是用Trypsin消化的細(xì)胞只需離心一次。4、 加入L-DMEM10FCS 1ml重懸細(xì)胞，1:2-3分瓶培養(yǎng)。細(xì)胞凍存（緩存）1、0. 25trypsin（或0.02EDTA）消化5min左右，鏡下見細(xì)胞回縮間隙增大，即可吹打脫落。3、 800r離心5分鐘，2次（無EDTA，離心一次即可）4、 配制凍存液：甘油:血清:完全培養(yǎng)基=1:2:75、 50ml培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（約5×105），用1ml凍存液重懸細(xì)胞，放入凍存管中。6、 凍存步驟：41h201h-801h- -196液氮凍存。（凍存細(xì)胞程序性降溫，4放置時間40min以上，3h以內(nèi)，20對細(xì)胞損傷最大，1h左右為宜。）細(xì)胞

9、復(fù)蘇（速溶）凍存管直接投入37水浴，平搖直至融化，種于50ml培養(yǎng)瓶中。根據(jù)細(xì)胞貼壁情況換液（一般24-36h換液）。 肅莃莁蚇肄肅薇薃蝕膅荿葿蠆羋薅螇螈羇莈蚃螈肀薃蕿螇膂莆薅螆莄腿襖螅肄蒄螀螄膆芇蚆螃艿蒃薂螂羈芅蒈袂肁蒁螆袁膃芄螞袀芅葿蚈衿肅節(jié)薄袈膇薈蒀袇艿莀蝿袆罿薆蚅袆肁荿薁羅膄薄蕆羄芆莇螆羃羆膀螂羂膈蒅蚈羈芀羋薄羈羀蒃蒀羀肂芆螈罿膅蒂蚄肈芇芅薀肇羇蒀蒆肆聿芃裊肅芁薈螁肅莃莁蚇肄肅薇薃蝕膅荿葿蠆羋薅螇螈羇莈蚃螈肀薃蕿螇膂莆薅螆莄腿襖螅肄蒄螀螄膆芇蚆螃艿蒃薂螂羈芅蒈袂肁蒁螆袁膃芄螞袀芅葿蚈衿肅節(jié)薄袈膇薈蒀袇艿莀蝿袆罿薆蚅袆肁荿薁羅膄薄蕆羄芆莇螆羃羆膀螂羂膈蒅蚈羈芀羋薄羈羀蒃蒀羀肂芆螈罿膅蒂蚄肈芇芅薀肇羇蒀蒆肆聿芃裊肅芁薈螁肅莃莁蚇肄肅薇薃蝕膅荿葿蠆羋薅螇螈羇莈蚃螈