乳酸鏈球菌素溶菌酶枯草芽孢桿菌大腸桿菌

1、乳酸鏈球菌素溶菌酶枯草芽孢桿菌大腸桿菌 乳酸鏈球菌素與溶菌酶天然防腐劑。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定乳酸鏈球菌素和溶菌酶的濃度及作用時(shí)間，響應(yīng)面試驗(yàn)確定最優(yōu)的抑菌條件。溶菌酶與乳酸鏈球菌素復(fù)配對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果顯著，反之乳酸鏈球菌素與溶菌酶復(fù)配對(duì)大腸桿菌的抑菌效果顯著。design-expert 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，建立各因素間數(shù)據(jù)模型。抑制枯草芽孢桿菌的最佳條件為：溶菌酶 0.20%處理 110min 以及乳酸鏈球菌素 0.21%處理 135min 下抑菌效果最佳，對(duì)大腸桿菌最佳比例：乳酸鏈球菌素 0.20%/20min 與溶菌酶 0.30%/135min 最佳。本實(shí)驗(yàn)研究可為溶菌酶、乳酸

2、鏈球菌素作為食品防腐劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。 關(guān)鍵詞 ： 乳酸鏈球菌素；溶菌酶；枯草芽孢桿菌；大腸桿菌 abstract nisn and lysozyme based natural preservatives. in this study, the concentration and action time of nisn and lysozyme are determined by single factor experiment, and the optimal bacteriostatic conditions are determined by response surfac

3、e test.it is found that the antibacterial effect of lysozyme compounding with nisn on bacillus subtilis is significant, while that of nisn compounding with lysozyme on bacillus coli is also significant. design expert 8.0 software is used for data fitting for the establishment of data model among var

4、ious factors. the best condition of inhibiting bacillus subtilis are: when lysozyme 0.20% is treated for 110 min and nisn 0.21% is treated for 135 min, the bacteriostatic effect is the best; and the best proportion to bacillus coli: when nisn 0.20% is treated for 20 min and lysozyme 0.30% is treated

5、 for 135min, the effect is the best. in a word, this experimental study can provide reference for the application of lysozyme and nisn as food preservatives in food industry. keywords: nisin；lysozyme；bacillus subtilis；escherichia coli 目 錄 1 1 引 言 . . 5 5 1.1 食品防腐劑. 5 1.2 天然防食品腐劑 . 5 1.3 溶菌酶、乳酸鏈球菌素抑菌

6、研究綜述 . 6 2 材料與方法 . . 6 6 2.1 材料試劑、儀器. 6 2.1.1 材料試劑 . 6 2.1.2 儀器. 7 2.1.3 供試菌種. 7 2.1.4 培養(yǎng)液培養(yǎng)基. 7 2.2 方法. 7 3 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 . . 7 3.1 單因素實(shí)驗(yàn) . 8 3.1.1 乳酸鏈球菌素對(duì)大桿菌腸及枯草芽孢桿菌抑菌活性影響 . 7 3.1.2 溶菌酶對(duì)大桿菌腸及枯草芽孢桿菌抑菌活性影響 . 8 3.1.3 乳酸鏈球菌素與溶菌酶的復(fù)合作用 . 9 3.2 響應(yīng)面優(yōu)化 . 12 3.2.1 枯草芽孢桿菌 box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 . 12 3.2.1.1 枯草芽孢桿菌 bbd

7、 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 . 11 3.2.1.2 枯草芽孢桿菌方差分析表 . 14 3.2.1.3 枯草芽孢桿菌的響應(yīng)面分析 . 17 3.2.2 大腸桿菌 box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 . 17 3.2.2.1 大腸桿菌 bbd 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 . 18 3.2.2.2 大腸桿菌方差分析表 . 19 3.2.2.3 大腸桿菌的響應(yīng)面分析 . 21 4 4 討 論 . . 2 22 2 參 考 文 獻(xiàn). 23 致 謝. 25 乳酸鏈球菌素及溶菌酶抑菌 響應(yīng)面優(yōu)化研究 1 引 言 1.1 食品防腐劑 防腐劑是一種可以防止食品腐敗、變質(zhì)，保證食品質(zhì)量和延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的重要食品添加劑1。隨著生活

8、水平的提高，消費(fèi)者越來(lái)越追求營(yíng)養(yǎng)豐富，無(wú)添加劑，綠色安全和保質(zhì)期較長(zhǎng)的的食品，由于微生物活動(dòng)和氧化等作用，食品很容易腐敗變質(zhì)，并且若誤食過(guò)期或變質(zhì)的食品還可能會(huì)造成食物中毒.因此食品的儲(chǔ)存需要有效的防腐方法1。按照防腐劑的組分和來(lái)源可分為化學(xué)類和天然類防腐劑，化學(xué)類防腐劑是將化學(xué)物質(zhì)添加到食品中但長(zhǎng)時(shí)間研究表明，有些化學(xué)防腐劑具有誘癌性、致畸性、低毒性以及某些潛在的危害1。而天然防腐劑安全性較高，但抗菌譜不廣、效率不高、防腐作用不突出的缺點(diǎn)，因此隨著人們生活水平的提高和綠色保健食品觀念的增強(qiáng)，在食品中添加純天然防腐劑的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到人們的重視和關(guān)注。隨著.的發(fā)展人們生活水平的提高以及綠色

9、保健食品觀念的增強(qiáng)，在食品中添加純天然防腐劑的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到人們的重視和關(guān)注，對(duì)此天然防腐劑的研究勢(shì)在必得。 1.2 天然防食品腐劑 天然防腐劑是指從植物、動(dòng)物和微生物中或其代謝產(chǎn)物中分離提取出來(lái)的一類具有抗菌防腐作用的功能性物質(zhì)，較化學(xué)防腐劑更安全1。具有抗菌性強(qiáng)、安全性高,熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)其來(lái)源可分為植物防腐劑、動(dòng)物防腐劑和微生物防腐劑1。有的是本身成分就是食品的組分，對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害，能增加或改善食品中的風(fēng)味和品質(zhì)，因此成為一類具有發(fā)展前景的食品防腐劑。 天然防腐劑具有抗菌性強(qiáng)、安全無(wú)毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等合成防腐劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。2 1.3 溶菌酶、乳酸鏈球菌

10、素抑菌研究綜述 1.3.1 溶菌酶 溶菌酶是水溶性的堿性蛋白質(zhì)，在酸性條件對(duì)熱穩(wěn)定性強(qiáng)，ph 在 3.0 時(shí)經(jīng)過(guò) 96的熱處理 15 分鐘依然能保持 87%的活性，在常溫條件下大多數(shù)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，當(dāng) ph 在 1.211.3 之間變化劇烈，但其結(jié)構(gòu)保持不變，活性也保持原樣。在堿性條件下易被破壞，熱穩(wěn)定性差。干燥情況下保藏時(shí)間長(zhǎng)。 1.3.2 乳酸鏈球菌素 乳酸鏈球菌素是多肽物質(zhì)中的一種，由 34 個(gè)氨基酸組成，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有強(qiáng)烈的抑制作用，因此在食品行業(yè)中應(yīng)用較廣，它是一種熱穩(wěn)定、高效、無(wú)毒且安全的天然防腐劑，在不同 ph 條件下溶解度也不同，在堿性條件下幾乎不溶解，對(duì)芽孢類細(xì)菌有很強(qiáng)的抑

11、制作用。 1.3.3 研究目的與意義 現(xiàn)在人們對(duì)食品的安全越來(lái)越重視，在食品加工中為了保證色香味俱全難免會(huì)添加一些防腐劑，然而化學(xué)防腐劑對(duì)我們?nèi)梭w不僅有害，在沒(méi)按規(guī)定添加量添加會(huì)使人體中毒，反之天然食品防腐劑綠色、安全、且對(duì)我們?nèi)梭w無(wú)害。 乳酸鏈球菌素和溶菌酶屬于天然防食品腐劑，對(duì)細(xì)菌的抑制起到一定的抑菌作用，一方面抑菌譜窄，另外一方面，但與化學(xué)防腐劑相比，其抑菌效率相對(duì)較差，因此，研究提高抑菌活性以及擴(kuò)大抑菌譜具有十分重要的意義。本文研究乳酸鏈球菌素和溶菌酶及聯(lián)合應(yīng)用抑菌活性。 2 材料與方法 2.1 材料、試劑及儀器 2.1.1 材料、試劑 溶菌酶、乳酸鏈球菌素、0.75%生理鹽水 2.1

12、.2 儀器 儀器 型號(hào) 生產(chǎn)廠家 恒溫培養(yǎng)箱 超凈工作臺(tái) 全自動(dòng)高壓滅菌鍋 電熱鼓風(fēng)干燥箱 恒溫培養(yǎng)搖床 dhp-9272a sw-cj-2d yxq-sg46-280s dhg-9070a nry-2021c 上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 蘇州凈化設(shè)備有限公司 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司 上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 上海南榮實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 2.1.3 供試菌種 革蘭氏陽(yáng)性菌種 枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis) 革蘭氏陰性菌種 大腸桿菌（escherichia coli) 2.1.4 培養(yǎng)液培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 操作步驟 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 稱取瓊脂干粉 33g1l 蒸餾水?dāng)嚢杓訜嶂林蠓蟹盅b后 121

13、高壓滅菌 15min 備用 營(yíng)養(yǎng)肉湯 稱取肉湯干粉 18g1l 蒸餾水?dāng)嚢杓訜嶂林蠓蟹盅b后 121高壓滅菌 15min 備用 2.2 方法 2.2.1 菌液培養(yǎng) 超凈工作臺(tái)中接種環(huán)劃線斜面接種，37恒溫培養(yǎng) 24h 活化。將活化的菌種接至營(yíng)養(yǎng)肉湯中 150rpm/37搖床培養(yǎng) 18h。 2.2.2 單因?qū)嶒?yàn) 2.2.2.1 乳酸鏈球菌素對(duì)大桿菌腸及枯草芽孢桿菌抑菌活性影響 在超凈工作臺(tái)中取 0.1ml（大腸桿菌或枯草芽孢桿菌）菌懸液加 0.75%生理鹽水 9.9ml 于 15ml 離心管稀釋,取稀釋液 0.1ml 加 0.75%生理鹽水 9.9ml 稀釋，菌溶約為 104 ，分別加不同溶度（0

14、.02%-0.20%）的乳酸鏈球菌素混勻，靜止作用1h 后分別取 0.1ml 液加 9.9ml 的 0.75%生理鹽水稀釋，分別取 1ml 稀釋液于培養(yǎng)皿中，倒入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻(注：培養(yǎng)基溫度不能過(guò)高，否則易燙死觀察菌），37恒溫培養(yǎng) 24h，觀察菌落菌數(shù)，取抑菌效果最好的濃度。同上步驟，用如上最好的抑菌濃度分別不同時(shí)間（20min-120min)，取最好的作用時(shí)間，同時(shí)做空白對(duì)照。 2.2.2.2 溶菌酶對(duì)大腸桿菌及枯草芽孢桿菌抑菌活性影響 超凈工作臺(tái)中取 0.1ml（大腸桿菌或枯草芽孢桿菌）菌懸液加 0.75%生理鹽水 9.9ml 于 15ml 離心管稀釋,取稀釋液 0.1ml 加 0

15、.75%生理鹽水 9.9ml 稀釋，菌溶約為 104 ，分別與不同溶度（0.02%-0.20%）溶菌酶作用 1h，取液 0.1ml 加 0.75%生理鹽水 9.9ml 稀釋，吸取 1ml 稀釋液于培養(yǎng)皿中，倒入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻(培電子天平 yp802n 上海精密科學(xué)儀器有限公司 養(yǎng)基溫度不能過(guò)高，否則易燙死觀察菌），37恒溫培養(yǎng) 24h，對(duì)菌落計(jì)數(shù)，確定優(yōu)化的濃度。 添加優(yōu)化的溶菌酶至菌懸液中，作用不同時(shí)間（20-120min)，進(jìn)行平板計(jì)法，方法同上，同時(shí)做空白對(duì)照。 2.2.2.3 乳酸鏈球菌素與溶菌酶的復(fù)合作用 （1）溶菌酶+乳酸鏈球菌素的復(fù)合作用 超凈工作臺(tái)中取 0.1ml（大腸桿菌

16、或枯草芽孢桿菌）菌懸液至 0.75%生理鹽水 9.9ml,取稀釋液 0.1ml 加 0.75%生理鹽水 9.9ml 稀釋，菌溶約為 104 ，加如上溶菌酶最好濃度與最好時(shí)間作用后，取液做空白對(duì)照，同時(shí)加如上乳酸鏈球菌素最好濃度與最好時(shí)間作用后，取液 0.1ml 加 0.75%生理鹽水 9.9ml 稀釋，取液 1ml于培養(yǎng)皿中，倒入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻(注：培養(yǎng)基溫度不能過(guò)高，否則易燙死觀察菌），37恒溫培養(yǎng) 24h，觀察菌落菌數(shù)，同時(shí)做空白對(duì)照 （2）乳酸鏈球菌素與溶菌酶的聯(lián)合作用 超凈工作臺(tái)中取 0.1ml（大腸桿菌或枯草芽孢桿菌）菌懸液加 0.75%生理鹽水 9.9ml 于 15ml 離心管

17、稀釋,取稀釋液 0.1ml 加 0.75%生理鹽水 9.9ml 稀釋，菌溶約為 104 ，加如上乳酸鏈球菌素最好濃度與最好時(shí)間作用后，取液做空白對(duì)照，同時(shí)加如上溶菌酶最好濃度與最好時(shí)間作用后，取液 0.1ml 加 0.75%生理鹽水9.9ml 稀釋，取液 1ml 于培養(yǎng)皿中，倒入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻(注：培養(yǎng)基溫度不能過(guò)高，否則易燙死觀察菌），37恒溫培養(yǎng) 24h，觀察菌落菌數(shù)，同時(shí)做空白對(duì)照。 2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化 用溶菌酶、乳酸鏈球菌素作為自變量（x 1 、x 2 ），抑菌率作為響應(yīng)值，box-behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。 3 結(jié)果與分析 3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 3.1.1 乳酸鏈球菌素不同濃度

18、對(duì)大桿菌腸及枯草芽孢桿菌抑制效應(yīng) 由乳酸鏈球菌素不同濃度抑菌活性可見(jiàn)圖 1 所示，對(duì)大腸桿菌最好抑菌濃度是(0.20%）,枯草芽孢桿菌最好的抑菌濃度為（0.14%）。 圖 1 乳酸鏈球菌素不同濃度對(duì)大桿菌腸及枯草芽孢桿菌抑制效 應(yīng) （濃度） 3.1.2 乳酸鏈球菌素不同時(shí)間對(duì)大桿菌腸及枯草芽孢桿菌抑制效應(yīng) 由乳酸鏈球菌素不同時(shí)間抑菌活性可見(jiàn)圖 2 所示，對(duì)大腸桿菌最好抑菌時(shí)間是（20min）,枯草芽孢桿菌最好的抑菌時(shí)間為（90min）。 圖 2 乳酸鏈球菌素不同時(shí)間對(duì)大桿菌腸及枯草芽孢桿菌抑制效應(yīng)（時(shí)間） 3.1.3 溶菌酶不同濃度對(duì)大桿菌腸及枯草芽孢桿菌抑制效應(yīng) 由溶菌酶不同濃度的抑菌活性可見(jiàn)圖 3 所示，對(duì)大腸桿菌最好抑菌濃度是(0.20%),枯草芽孢桿菌最好的抑菌濃度為（0.20%)。 92.5% 92.5% 93.5% 93.5% 93%90.1%94.9%92.5% 93.2%93.5%43.6%36.3%44.3% 44% 43.6%46.8%51%56.2%54.2%66.1%01020304050607080901000.02% 0.04% 0.06% 0.08% 0.10% 0.12% 0.14% 0.16% 0.18% 0.20%抑菌率（%）濃度（%）枯草芽孢桿菌 大腸桿菌49.2%49.6% 52.3%45%49.2%47.7%51.5%57.6%50%5