DotBlot檢測流程

1、第九章免疫學活性測定Dot blot 原理：原理：抗原抗體和受體配體結合可以被利用作蛋白質簡單快速的定量 分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗體或者受體配體可以被標記的 抗體識別并進行定量記數(shù)形成定量分析方法的基礎。由于細胞培養(yǎng)需 要不斷監(jiān)測，工作量很大。因此快速簡潔的定量分析是檢測細胞表達 水平監(jiān)測的重要手段。主要監(jiān)測方法包括Dot blot和ELISA。Dot blotDot blot是最快速簡捷的方法之一，簡述如下：在超凈臺內(nèi)，使 用無菌多孔加樣器將96孔板內(nèi)的細胞克隆培養(yǎng)液以5gL上樣量，成 排點于硝酸纖維素膜上并風干，記錄好樣品順序（可在膜的正面邊緣 處標記正面及名稱，也可通過在膜的右

2、下角剪去一角作為標記，識別 膜的正反面及方向）。取上面風干好的硝酸纖維素膜，用配制好的封 閉液（脫脂奶粉或白蛋白溶液）室溫震蕩孵育至少一小時。此步驟的 目的是封閉硝酸纖維素膜上的非特異性蛋白結合位點，以避免下一步加入的抗體與膜發(fā)生非特異性結合。將封閉好的硝酸纖維素膜浸泡在 第一抗體中，室溫震蕩孵育1小時，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后， 將膜浸泡到TTBS溶液中，室溫震蕩洗滌3次，每次5分鐘。將洗滌 后的硝酸纖維膜浸泡在含有酶標第二抗體溶液中，室溫震蕩孵育1小時，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，將膜浸泡到TBST溶液中，室 溫震蕩洗滌3次，每次5分鐘。最后，將膜浸于熒光顯色劑（新鮮剛剛混合的等

3、量A和B液）。1-2分鐘后將浸泡過的膜，抖去多余顯色 劑，夾入保鮮膜（保鮮膜應薄而透明，以免阻擋曝光效果）中，同時 觀察顯色情況，確定大致曝光時間（一般情況下，如果樣品亮度肉眼 可見且較強，那么初次曝光時間應較短，一般選3-5秒；如果樣品亮度肉眼不可見，則初次曝光時間應略長一些，一般選擇1分鐘），曝光完畢，經(jīng)顯影，定影后，用清水沖洗 X光膠片，根據(jù)膠片上結果 情況，再將膜放入曝光暗盒中進行二次曝光及顯影、定影反應。溶液 配制及整個操作過程請斑點雜交操作流程圖。Dot blot需要TTBS溶解的倍比稀釋后的標準品做對照方能進行半定量。 同時樣品倍比稀釋 也是半定量所必需。附1: Dot-Blot

4、操作流程圖以下均用微振搖床混和一、試劑1、抗待檢樣品抗體：第一抗體為純化鼠抗人IgG Fc 單抗； 第二抗體為HRP-兔抗小鼠IgG二抗。2、封閉液（5%脫脂奶粉）3、底物熒光顯色劑A、B4、TTBS（10 X ） 緩沖液：取三羥甲基氨基甲烷（Tris）60.5g, NaCl 45g ,吐溫-80 5.5ml ,加適量超純水溶解，用濃鹽酸（32ml）調PH7.5 ,補加超純水 至500ml。置于棕色瓶中，4 C保存，有效期6個月。用前10倍稀釋為1 X TTBS緩沖液。二、操作1、取硝酸纖維素膜1張，將標準品倍比稀釋、樣品、陰性對照、陽性對照點 在膜上，風干。2、將膜置于封閉液（5%脫脂奶粉溶

5、于超純水中）室溫封閉1小時（也可4 C 過夜封閉）。3、棄去封閉液后，加入含有待檢樣品第一抗體的TTBS緩沖液30mL （抗體稀 釋度為1 : 1000 ）,且其中含有1%的脫脂奶粉，室溫震蕩孵育1小時。4、將硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液充分淋洗兩次，每次洗后都盡量棄去溶液。 然后再用TTBS緩沖液震蕩洗滌3次，每次5分鐘。5、棄去液體后，加入含有第二抗體的TTBS緩沖液30mL （抗體稀釋度為1 : 2000 ）,室溫震蕩孵育1小時。6、將硝酸纖維素膜用TTBS緩沖液充分淋洗兩次，每次洗后都盡量棄去溶液。 然后再用TTBS緩沖液震蕩洗滌3次，每次5分鐘。7、取出硝酸纖維素膜，略除去膜上多余溶

6、液后，加入適量的熒光顯色劑A、B （一般1/2張96孔板大小的膜加4mLA、B混合液，且A液：B液=1 : 1）。8、用保鮮膜將硝酸纖維素膜覆蓋，盡量平整，避免產(chǎn)生氣泡，并放在曝光夾 上，根據(jù)樣品及標準品的亮度，初步確定曝光時間（一般情況下，如果樣品亮度 肉眼可見且較強，那么初次曝光時間應較短，一般選 3-5秒；如果樣品亮度肉眼不可見，則初次曝光時間應略長一些，一般選擇1分鐘），然后取適 當大小的膠片覆蓋在薄膜上，關夾曝光。8、曝光后，取出膠片浸于顯影液中， 在紅光下觀察，直到膠片上的樣品點不再變化為止（1.5分鐘），取出膠片在水中涮洗一下（此步驟避免顯影液與定影液混合，降低定影液使用 效率）

7、，再放入定影液中，當膠片本底呈現(xiàn)藍色透明后，即可取出膠片進行流水沖洗， 洗凈后晾干即可。此實驗中的注意事項：（1）在整個操作過程中，手不能直接接觸硝酸纖維素膜，以免蛋白污染或造成蛋白降解；（2）脫脂奶粉封避一定要充分，否則容易造成膜與蛋白的非特異性結合，導致結果片中出 現(xiàn)雜點或假陽性，干擾試驗結果。（3）一抗?jié)舛扰c二抗?jié)舛炔灰诉^高，否則容易造成高背景或者雜點。適宜濃度的選擇，可 以通過不同濃度組合的預試驗進行確定。（4） 暗室一定要確保其不漏光，否則容易造成X光片跑光，整個光片全黑的情況。（5）曝光時，時間的確定應該具體情況具體分析，需要一定的實踐經(jīng)驗積累。ELISA1、雙抗體夾心法：本法適用

8、于樣品含量低靈敏度要求高的定量分析， 簡述如下。先用選定的第一抗體（單抗原結合點的單抗為首選）在堿 性條件下（一般PH=8.08.5碳酸鹽緩沖液）包裹96孑板，置4C過 夜或者室溫1小時。然后用排槍或真空吸管吸出一抗，再用 BSA或 稀釋的奶粉封閉45至60分鐘。封閉后用洗滌液洗板2次。加入待測 抗原樣品（條件培養(yǎng)液）和標準品（PBS稀釋）。用洗滌液洗板2次。 加入標記好的相應抗體室溫1小時。用洗滌液洗板2次。如果不是標 記的抗體，可再用標記的抗一抗抗體（二抗）重復以上步驟再加入底物 液顯色和上機讀數(shù)。2、間接法：適用于靈敏度要求低，樣品含量高的分析方法，步驟如 下。將制備好的標準品及樣品，加

9、至 96孔酶標板，置4C過夜，或室 溫放置3小時。用洗滌液PBS-T配制的1%BSA溶液加至板內(nèi)，37C 放置1小時。將封閉好的酶標板用洗滌液洗板 2次。將一抗加至板內(nèi)， 同時加入兩孔空白對照（稀釋液），37 C放置1小時。用稀釋液稀釋 HRP酶標記的第二抗體加至板內(nèi)，37C放置1小時。用洗滌液洗板2 次。加入底物液顯色和上機讀數(shù)。注：終止液可加可不加。3、結合競爭法：放射免疫法是典型的競爭法。它利用同位素標記抗原（I-125）與非標記抗原競爭結合抗體。非標記抗原或者樣品中的 抗原越多標記的抗原（I-125）與抗體結合的越少。一定濃度的 PEG 可以沉淀抗體結合的標記的抗原（即抗原-抗體復合物

10、），但不可以 沉淀游離的抗體或抗原（即非結合的抗原或者抗體）。沉淀的抗原 - 抗體復合物離心后吸出上清中的非結合的抗原或者抗體可以經(jīng)過放 射性計數(shù)定量。標準品或樣品中的待測抗原越少計數(shù)越高。根據(jù)這個道理可以畫出標準曲線和查出相應標準品中的抗原含量。此法靈敏度高于其它方法，可達到10-100pg/ml水平，適用于血漿和組織藥物濃 度的動力學研究（藥物PK study）。4、新方法的建立原則1）以上所有方法的建立主要取決于抗體質量的好壞，因此多試幾個商品化的抗體有必要。2)般情況下，先決定所測樣本中抗原量的最低和最高限度,即測定范圍。原則上要求抗原和抗體的濃度等量，比如新方法要求檢測抗原濃度在11

11、0mg/L范圍內(nèi)，靈敏度要求是1mg/ml，最高濃度 10 mg/ml，高于10 mg/ml使用樣品倍比稀釋的方法來解決。此時， 檢測抗原濃度在1mg/L,假設需要100%抗原抗體結合的有效抗體稀 釋度為1: 8000,又假設需要100%抗原抗體結合的有效抗體稀釋度 為1: 4000。因此決定此法有效抗體稀釋度在 1: 8000到1: 4000 之間。我們的結論是一般情況下抗原的濃度降低則抗體的相對濃度也 降低。如果想提高方法的抗原探測靈敏度，一般使用相對低濃度的抗體。如果想降低方法的抗原探測靈敏度，一般使用相對高濃度的抗體。3） 分析方法的變異范圍（代表可靠程度）一般用CV （Coeffic

12、ient variant）來計算。CV=SD （標準差）/X（平均值）X100%。一般批內(nèi)（intra-assa的CV要小于批間（inter-assay）的CV。例如N 個（N至少要大于6）同一代測標本在一次方法分析中相差會很小，即CV很?。–V=5-10%可以接受）。又如N個同一代測標本在多次 方法分析中相差會很大，即 CV很大（CV=10-30%可以接受）。批內(nèi) 和批間變異是最常用的定量分析控制方法。一般低溫（-30 C或以上） 長期貯存的質量控制用標準品在每次方法分析中都要使用， 這就是常 用的定量分析方法的質量控制。附：單克隆抗體制備原理單克隆抗體的制備過程包括經(jīng)典的細胞克隆化步驟理解

13、單克隆抗體的制備不但有助于理解細胞克隆化的方法，還有助于理解分析方 法中抗體的選用。簡單地說，將一定濃度的抗原免疫小鼠，取小鼠脾臟，無菌磨碎， 取懸浮的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞在體外在一定濃度PEG的作用下（PEG可將2個或多個細胞融合在一起）融合形成雜交瘤細胞。經(jīng)過 HAT培養(yǎng)液在96孔細胞培養(yǎng)板中篩選，死亡者為未融合的小鼠骨髓 瘤細胞（HAT培養(yǎng)液可殺死小鼠骨髓瘤細胞）和不能傳代生長的小 鼠脾臟細胞（高度分化細胞不能傳代生長）。幸存者（即可在HAT培養(yǎng)液中生長的細胞）為融合的雜交瘤細胞。雜交瘤細胞具有小鼠脾 臟細胞和小鼠骨髓瘤細胞共同的特性，因此可以在HAT培養(yǎng)液中傳代生長。使用簡單的抗體抗原結合的方法可以測定 96孔板中每孔中雜交 瘤細胞的抗體分泌量。選出分泌量最高的雜交瘤進行細胞擴增， 再克 隆，鑒定抗體的類型和親和力，IgG為首選。以上就是單克隆抗體制 備的簡單過程。附：多克隆抗體制備原理將一定濃度的抗原免疫大鼠或兔羊馬的起初產(chǎn)生的免疫球蛋白為IgA IgM,后期大量產(chǎn)生IgG, IgG可分為IgGi I