普通光學(xué)顯微鏡的使用及微生物制片及染色技術(shù)

1、普通光學(xué)顯微鏡的使用及微生物制片及染色技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的使用方法.2、學(xué)習(xí)掌握單染色的操作技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù)。3、了解革蘭氏染色機(jī)理，并掌握其操作技術(shù)。4、掌握劃線分離純化微生物的原理與方法實(shí)驗(yàn)材料:1、器材：滅菌棉簽（裝在試管內(nèi)），試管架，記號(hào)筆和廢物缸、培養(yǎng)皿、試管、三角燒瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角勺、高壓蒸汽滅菌鍋、ph試紙、棉花、牛皮紙、麻繩、錐形瓶、洗瓶、載玻片、接種杯、 酒秸燈、擦鏡紙、顯微鏡2、染色液和試劑：牛肉膏、蛋白豚、nacl.瓊脂鹽酸溶液、軾氧化鈉溶 液、無(wú)菌水、結(jié)晶紫、95%酒精、蕃紅、碘液3、活材料：枯草桿菌、培養(yǎng)24小時(shí)的

2、大腸桿菌、金黃色衞萄球菌三、實(shí)驗(yàn)原理：1、用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染 料的離子帶止電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng) 它牛長(zhǎng)丁中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采丿ij堿性染料 如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料離子帶負(fù)電荷， 能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基ph下降時(shí)，細(xì)菌所 帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料焰前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。2、簡(jiǎn)單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，簡(jiǎn)單染色不能辨別細(xì) 菌細(xì)胞的構(gòu)造

3、3、革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家c.gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可 將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（gj和革蘭氏陰性菌（gj兩大類，是細(xì) 菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為ct菌和g菌，是由這 兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。菌的細(xì)胞樂(lè)小含有較多易被乙 醇溶解的類脂質(zhì)，而口肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了 類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果 細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。g*菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度髙 ，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因 此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的

4、顏色。4、水的沸點(diǎn)可隨壓力的增加而提窩，當(dāng)高壓蒸汽滅菌鍋中水煮沸時(shí)，鍋是密閉 的，蒸汽不能溢出，而使壓力増加，水的沸點(diǎn)和溫度也隨z增加。因此，高壓蒸 汽滅菌是利用高床蒸汽產(chǎn)生的高溫，以及熱蒸汽的穿透能力來(lái)達(dá)到滅菌的目的。一般在o.impa (151b/in2)的壓力時(shí),溫度可達(dá)121°c只要維持1520min,就可 殺死一切微牛物的營(yíng)養(yǎng)體和它們的各種砲子。四. 實(shí)驗(yàn)步驟i o微生物的分離與純化1牛肉膏蛋白懂的制備(1) 計(jì)算 根據(jù)配方計(jì)算出實(shí)驗(yàn)中各種藥甜所需要的量。(2) 稱量 準(zhǔn)確稱取各種成分，一起放入燒杯中。(3) 溶解 向燒杯內(nèi)加入所需的水量，并加熱融化。(4) 調(diào)ph值 川p

5、h試紙測(cè)定其ph值，并川氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。(5) 轉(zhuǎn)移滅菌 將配好的培養(yǎng)棊裝入配有棉塞的三角瓶?jī)?nèi)。(6) 包扎 三角瓶的棉塞外用牛皮紙包扎，紙上表明培養(yǎng)基的名稱、配制日期等。2、培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌(1) 加水于滅菌器內(nèi)到規(guī)定的水平而。(2) 需滅菌的物品，培養(yǎng)基及包扎好的培養(yǎng)皿放入滅菌鍋內(nèi)的套筒中。擺放要疏松， 太擠，否則阻礙蒸汽流通，影響滅菌效果。(3) 將滅菌鍋蓋的排氣管插人套筒側(cè)壁的凹槽內(nèi)，關(guān)閉滅菌鍋蓋旋緊螺栓，切勿漏氣。(4) 打開(kāi)放氣閥，加熱，熱蒸汽上升，以排除鍋內(nèi)冷空氣，排氣約5lomin,關(guān)閉放氣閥。(5) 關(guān)閉放氣閥后，整個(gè)滅菌鍋成為密閉狀態(tài)，而蒸汽乂不斷增多，

6、這吋?jí)毫蜏囟榷?升，直至床力衣指針達(dá)到所需壓力時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)熱源，維持此壓力到所需 時(shí)間。(6) 滅菌完畢，待壓力自然降至0時(shí)，打開(kāi)放氣閥，注意不能打開(kāi)過(guò)早，否則突然降壓致 使培養(yǎng)基沖騰，使棉塞、硅膠泡沫塞沾污，甚至沖出容器以外。(7) 打開(kāi)滅菌鍋蓋，取出已滅菌的器皿及培養(yǎng)棊。滅菌鍋用完后，將鍋內(nèi)剩余的水倒掉, 以免日久腐蝕。3、微生物的分離與純化 分區(qū)域用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底劃出三個(gè)區(qū)域，由小到大依次標(biāo)記1、2、3,留下備用 倒平板：右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹?，左?拿培養(yǎng)肌并將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒人培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動(dòng)使培養(yǎng)基均勻分

7、布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌而上，待凝后即為平板，并用記號(hào)標(biāo)明培養(yǎng)棊名稱 劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，接種環(huán)燒完后，挑去培養(yǎng)皿內(nèi)的菌種， 然后在標(biāo)記號(hào)的培養(yǎng).iiil中劃線?，F(xiàn)在一區(qū)中劃，然后加熱接種環(huán)，從一區(qū)中引出一條菌線， 在二區(qū)中劃線，依次法在三區(qū)中劃線。劃線時(shí)一區(qū)較緊湊，二區(qū)較松，三區(qū)最松。 將整理好的培養(yǎng)皿放入恒溫條件卜培養(yǎng)，留待觀察。ii、微生物制片及染色技術(shù)及普通光學(xué)顯微鏡的使用1、簡(jiǎn)單染色:（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片上加一滴蒸懾水，將接種環(huán)加熱消毒后，等溫度 變低后，取金黃色葡萄球菌涂抹到蒸懾水內(nèi)。（2）晾干：讓涂片自然晾干或者在酒粘燈火焰上方文火烘干

8、。注意不要使裝片溫度過(guò)高。（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過(guò)火焰23次固定（以不燙手為宜）（4）染色：將固定過(guò)的涂片放在廢液缸上的擱架上，加結(jié)晶紫染色一分鐘。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無(wú)色為止（注: 勿沖去菌體）。（6）干燥：將洗過(guò)的涂片放在空氣中晾干或川吸水紙吸干。留下備川。2、革蘭氏染色:（1）涂片：取t凈載玻片一塊，在載玻片上加四滴蒸綢水，將接種環(huán)加熱消毒后，等溫度 變低肩，取金黃色葡萄球菌涂抹到蒸鐳水內(nèi)，然后再將接種環(huán)加熱消毒后，等溫度變低，取培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌到蒸蝕水屮，依此法再涂抹枯草桿菌以及z 前接種純化的菌。（2）晾干：與

9、簡(jiǎn)單染色法相同。（3）固定，與簡(jiǎn)單染色法相同（4）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂而）的結(jié)晶紫 染色液染色1分鐘。（5）水洗：傾去染色液，川水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無(wú)色為止（注：勿沖去菌 體oo（6）媒染：滴加碘液，媒染lmin。（7）水洗：用水洗去碘液，傾去染色液，用水自玻片-端輕輕沖洗至流下的水變無(wú)色為止（注：勿沖去菌體）。（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-25s至流出液無(wú)色，立即水洗。（9）復(fù)染:滴加蕃紅復(fù)染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液，傾去染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下 的水變無(wú)色為止（注：勿沖去菌體）

10、。（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。放置好備用。3、鏡檢（1）取鏡和放置：顯微鏡平吋存放在柜或箱中，用吋從柜中取出，右手緊握鏡臂，左一手托 住鏡座，將顯微鏡放在白己左肩前方的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座后端距桌邊12寸為宜，便于坐著 操作。（2）把顯微鏡取出，然后接電到止確的插座（3）檢杳有無(wú)臟污,有的話沾些許95 %的酒精除去臟污（4）打開(kāi)并調(diào)整光源，避免燈源高度太強(qiáng)，使微生物檢體死亡（5）放置玻片標(biāo)本：取一玻片標(biāo)木放在鏡臺(tái)上，一定使有蓋玻片的一而朝上，切不可放反，用 推片器彈贊夾夾住，然后旋轉(zhuǎn)推片器螺旋，將所耍觀察的部位調(diào)到通光孔的止中。（6）調(diào)節(jié)焦距：以左手按逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)

11、器，使鏡臺(tái)緩慢地上升至物鏡距標(biāo)本片約5毫 米處，應(yīng)注意在上升鏡臺(tái)時(shí)，切勿在目鏡上觀察。一定要從右側(cè)看著鏡臺(tái)上升，以免上升 過(guò)多，造成鏡頭或標(biāo)本片的損壞。然后，兩眼同時(shí)睜開(kāi)，在目鏡上觀察，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié) 器，使鏡臺(tái)緩慢下降，待物像出現(xiàn)后，在轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)輪反復(fù)微調(diào)，直到影像清晰為止 如果物象不在視野中心，可調(diào)節(jié)推片器將其調(diào)到中心（注意移動(dòng)玻片的方向與視野物象移動(dòng) 的方向是相反的）。如果視野內(nèi)的亮度不合適，可通過(guò)調(diào)節(jié)光源亮度，如果在調(diào)節(jié)焦距時(shí)， 鏡臺(tái)下降已超過(guò)工作距離（5.40mm）而未見(jiàn)到物象，說(shuō)明此次操作失敗，則應(yīng)重新操作， 切不可心急而有目地上升鏡臺(tái)。（7）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，調(diào)換上高倍鏡頭，轉(zhuǎn)換高倍鏡

12、時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)速度要慢，并從側(cè)而進(jìn)行觀察（防止高 倍鏡頭碰撞玻片）。（8）調(diào)節(jié)焦距：轉(zhuǎn)換好高倍鏡后，用在h鏡上觀察，此時(shí)一般能見(jiàn)到一個(gè)不太清處的物象，可 將細(xì)調(diào)節(jié)器螺旋，可獲得清晰的物彖（切勿川粗調(diào)節(jié)器!）（9）如果視野的亮度不合適，可用顯微鏡上的燈來(lái)調(diào)節(jié)，如杲需要更換玻片標(biāo)本時(shí)，必須順 時(shí)針（切勿轉(zhuǎn)錯(cuò)方向）轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使鏡臺(tái)下降，方對(duì)取下玻片標(biāo)本。（10）在使用油鏡z前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。（11）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開(kāi)通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加-滴香柏油，然后慢 慢轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。（12）用觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重找，在加油區(qū)之外重找時(shí)應(yīng)按：低倍一高倍一油鏡程序。 在加油區(qū)內(nèi)重找應(yīng)按：低倍一油鏡程序，不得經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。（13）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許二卬苯將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油擦去，然后再用干 擦鏡紙擦干凈。（14）實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)將顯微鏡收拾干凈，將接物鏡轉(zhuǎn)至最低倍數(shù)，關(guān)閉電源，拔掉插頭，收入 保存箱或戴上防塵套4、觀察時(shí)記錄圖像。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)困名稱菌體顏色細(xì)菌形態(tài)結(jié)果(g+/g-)