細胞培養(yǎng)準備工作

1、.一：細胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)備:1. 儀器:(1) 倒置相差顯微鏡(2) CO2培養(yǎng)箱(3) 電熱干燥箱(4) 水純化裝置(5) 冰箱:普通冰箱(培養(yǎng)液,生理鹽水,Hanks液,短期保存的組織標本)和-20冰箱(保持生物活性及較長時間存放的制劑如酶,血清等)(6) 液氮容器:儲存細胞(7) 離心機(4000rpm,1000rpm即可及天平(8) 高壓蒸氣消毒氣(9) 濾器:Zeiss濾器,玻璃濾器,微孔濾器等。(一次性濾器：12.00×10)(10) 消毒培養(yǎng)液，(11) 血清(12) 消化用胰酶等。2培養(yǎng)用器皿：（1） 培養(yǎng)瓶：250ml,100ml（4.50×20）,25m

2、l（3.50×10）（2） 培養(yǎng)皿：10cm,9cm（3.50×10）,6cm（2.50×10）,3.5cm（3） 多孔培養(yǎng)板：96孔（16.50×1），24孔（16.50×3），12孔，6孔，4孔（4） 玻璃瓶：1000ml,500ml,250ml,100ml,50ml,25ml,5ml（5） 吸管：刻度吸管（吸取，轉(zhuǎn)移液體：1ml,2ml,5ml,10ml）（3.00×10）直頭吸管（吸取，轉(zhuǎn)移液體）彎頭尖吸管（吹打，混勻，傳代細胞）（6） 加樣器：微量加樣器用于吸取，移動液體，滴加樣品（7） 其他用品：鋁飯盒，橡皮吸頭，膠塞，注

3、射器，燒杯，量筒，漏斗3器械：（1） 手術(shù)刀（2） 手術(shù)剪，眼科剪（18.50）（3） 血管鉗（4） 眼科鑷（8.50），小彎頭鑷（5） 鐘表鑷二培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌：1 各種類型毛刷,橡膠手套，消毒所用包裝（牛皮紙，棉布，棉線等）2 洗衣粉，洗滌劑3 5稀鹽酸浸泡中和堿性物質(zhì)4 清潔液（次強液：重鉻酸鉀120g，濃硫酸200ml，蒸餾水1000ml）需陶瓷或塑料器皿5 消毒劑：75酒精或0。1新潔爾滅消毒皮膚，無水乙醇（用于酒精燈）6 抗菌素：青霉素，鏈霉素三：培養(yǎng)用液：1 平衡鹽溶液：D-HANKS液(g/l )PH試紙Nacl 8.00, kcl 0.40, Na2HPO4.H20

4、0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35,酚紅0.022 合成培養(yǎng)基：M199培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基（Gibico公司 一袋1000ml 65.00,Hepes 25g 120.00）DMEM 一袋，Hepes 3.57g,NaHCO3 2.2g,三蒸水1000ml，青霉素100u/ml,鏈霉素100ug/ml ph=7.27.43 FBS胎牛血清（原代培養(yǎng)20傳代培養(yǎng)10）(100ml 200.00)四：組織塊的分離方法：1 剪切分離法：組織塊在0.5mm22mm2內(nèi)，大小影響不大（可調(diào)整翻瓶時間以保證組織塊貼壁），關(guān)鍵在于組織塊邊緣整齊，光滑，要求取材迅速，動作輕柔，剝除

5、外膜時用力適中避免機械損傷，將鑷子夾過處剪去，血管縱向剖開后平鋪于平皿上，手術(shù)刀片無菌，潔凈，鋒利，垂直下刀，力求一次切斷，不要離開培養(yǎng)液操作，保持邊緣濕潤。2 消化分離法：（1） 胰蛋白酶法：(25g 210.00)（2） 膠原酶法：五：原代培養(yǎng)方法：1 貼塊法：在培養(yǎng)皿內(nèi)將組織塊剪成1mm3左右的小塊，剪時可滴加12培養(yǎng)液，以保持濕潤。將剪切好的小塊用吸管吸入培養(yǎng)瓶中，均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊朝上，向瓶內(nèi)注入少許培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶傾斜放置在37度培養(yǎng)箱內(nèi)。6小時后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)。若組織塊不易貼壁，可預(yù)先在瓶壁涂薄層血清，胎汁。（10胎牛

6、血清，10胎兒血清，0。03 L-谷氨酰氨。110mg/l丙酮酸鈉，100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素） 貼塊法具有獲得平滑肌細胞純度高，量多，操作簡便的優(yōu)點。但用貼塊法易使平滑肌細胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失，亞細胞器增加。2 酶解法：組織塊剪成12mm3,轉(zhuǎn)入新鮮配置的0。2型或型膠原酶消化液中，37恒溫搖床（25r/min）消化，消化液混濁，尚存有較小組織塊時，將消化液移入離心管內(nèi)，收集細胞并用培養(yǎng)液輕輕吹打混勻。細胞計數(shù)（0。1臺盼藍），50ml培養(yǎng)瓶接種約8×105活細胞。（沿動脈縱軸切開后，刮除內(nèi)皮細胞撕下中膜的內(nèi)2/3，注意不要混入內(nèi)皮細胞，將組織塊切成1-2mm2，放入

7、加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養(yǎng)基中，37，0.51.5h。離心去上清，重復(fù)上述消化步驟，然后再離心（9000r,4min），收集細胞，在5%10%同種血清或胎牛血清的M199培養(yǎng)基中調(diào)整細胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)入3090mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)） 酶解離法，由于酶的作用使細胞間失去連接，細胞內(nèi)肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài)。3 貼塊酶解法：對未消化完全的組織塊采用貼塊法接種瓶壁，先置培養(yǎng)箱2h使組織塊干固，然后補加培養(yǎng)液，37靜置培養(yǎng)，3d后換液。4 注意：種植組織塊的數(shù)目，如75cm2的長頸瓶組織塊不得少于30個；根據(jù)培養(yǎng)細胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應(yīng)加胎牛

8、血清（FBS），通常濃度為10%20%六：傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)35d，需換液一次，去除飄浮的組織塊和殘留的血細胞。然后隔天換液。當內(nèi)皮細胞長成單層，平滑肌細胞出現(xiàn)峰谷樣特點時可傳代。消化法傳代。加入0.125胰蛋白酶1ml，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使胰酶充分接觸細胞后去除大部分液體，鏡下觀察，35min后，細胞呈收縮狀，棄盡消化液，DMEM培養(yǎng)液洗兩遍，加10FCS DMEM培養(yǎng)液，用彎頭吸管輕輕均勻吹打細胞，使細胞自瓶壁脫落，鏡下觀察細胞計數(shù)，按1：23比例傳代。七：細胞系的維持：八：培養(yǎng)細胞的純化：九：細胞凍存與復(fù)蘇：十：培養(yǎng)細胞生長狀況的觀察：1 肉眼觀察培養(yǎng)液：顏色，透明度2 相差顯微鏡下觀察：

9、0/wjf/2/course/c212.htm 相差顯微鏡與倒置顯微鏡的區(qū)別 光學(xué)倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細胞形狀多樣，一般常為梭形、帶形、三角形或星形。貼塊法培養(yǎng)，細胞可于2周后長成單層；而酶解離只需67天，鏡下可見明顯“峰-谷”樣生長。透射電子顯微鏡下觀察：貼塊法，細胞多為合成型，肌絲減少，胞體縮小，細胞胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、線粒體等亞細胞器逐漸增多。消化法，細胞初期表現(xiàn)為收縮型，細胞內(nèi)核位于中心，胞質(zhì)內(nèi)含豐富的肌絲及致密度體。亞細胞器少，且位于細胞邊緣處，基底膜最初未見，后來逐漸形成。傳代后，細胞逐漸轉(zhuǎn)為合成型，胞體增大且變扁平，核增大，核小體數(shù)目增加，亞細胞器也增加，肌絲開始減少，占胞內(nèi)35.4%11.5%,甚至更少。在生化性質(zhì)方面，收縮型細胞比合成型細胞的-極密度脂蛋白（-VLDL）對其受體結(jié)合能力強，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂質(zhì)容易在胞質(zhì)沉著。此外，像基底膜中的肝素樣物質(zhì)、膽固醇代謝等也有改變。合成型細胞內(nèi)色素C氧化還原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈34倍增加，說明這兩類細胞不僅在形態(tài)學(xué)上，在生化、生理反應(yīng)方面也發(fā)生了較大改變。3 細胞生長狀況的觀察：細胞計數(shù)：計數(shù)板4 細胞活力的檢測方法：四唑鹽（MTT）比色試驗（1）：0.125%胰蛋白酶消化（2）：加10FCS的DMEM培養(yǎng)基（3