流式細(xì)胞儀的原理和用途

1、精品文檔流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry )1流式細(xì)胞儀的概念及其發(fā)展歷史1.1流式細(xì)胞儀的基本概念流式細(xì)胞儀(flow cytonletry , FCM是對(duì)高速直線流動(dòng)的細(xì)胞或生物微粒進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分選技術(shù)，計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)的采 集和分析技術(shù)等。 流式細(xì)胞儀以流式細(xì)胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、分子免疫 學(xué)、細(xì)胞熒光化學(xué)和計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識(shí)綜合運(yùn)用的結(jié)晶。流式細(xì)胞術(shù)是一種自動(dòng)分析和分選細(xì)胞或亞細(xì)胞的技術(shù)。其特點(diǎn)是：測(cè)量速度快、被測(cè)群體大、可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，即對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、生物化 學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)

2、上有效。1. 2流式細(xì)胞儀的發(fā)展簡(jiǎn)史最早的流式細(xì)胞儀雛形誕生于1934年，Moldavan提出使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞流過(guò)玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用光電記錄裝置測(cè)量的設(shè)想。1953年 Crosland-Taylor 根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律設(shè)計(jì)了流動(dòng)室。其后又經(jīng)過(guò) Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde Fulwyler、Herzenberg等人的不斷改進(jìn)，設(shè)計(jì)了光電檢測(cè)設(shè)備和細(xì)胞分選裝置、完成 了計(jì)算機(jī)與流式細(xì)胞儀的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析、開(kāi)創(chuàng)了細(xì)胞的免疫熒光染色及檢測(cè)技術(shù)、 推廣流式細(xì)胞儀在臨床上的應(yīng)用。近20年來(lái)

3、，隨著流式細(xì)胞儀及其檢測(cè)技術(shù)的日臻完善，人們?cè)絹?lái)越致力于樣品制備、細(xì)胞標(biāo)記、軟件開(kāi)發(fā)等方面的工作，以擴(kuò)大FCM勺應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。宋平根的流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用是迄今為止對(duì)流式細(xì)胞儀及其技術(shù)闡述的最為詳盡和透徹的中文著 作。這本書(shū)非常詳細(xì)地介紹了流式細(xì)胞術(shù)的歷史、結(jié)構(gòu)、原理、技術(shù)指標(biāo)等，例舉了其在醫(yī)學(xué)和生物工程 中的應(yīng)用，非常適合從事此方面專業(yè)研究的人。由于這本書(shū)是13年前出版的，所以基本上沒(méi)有涉及植物流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)。此外對(duì)于只需要對(duì)流式細(xì)胞儀有些基本認(rèn)識(shí)的人士來(lái)說(shuō)，這本書(shū)太復(fù)雜太深?yuàn)W。謝小 梅主要介紹了流式細(xì)胞儀在生物工程中的應(yīng)用。楊蕊概括了流式細(xì)胞儀的工作原理，簡(jiǎn)單提及了流式細(xì)胞 儀

4、的應(yīng)用。本文在分析這三篇論著或文章的優(yōu)缺點(diǎn)后，用比較通俗的語(yǔ)言介紹了掌握流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù) 必須了解的一些原理，并對(duì)目前市場(chǎng)上的主流型號(hào)進(jìn)行了客觀的性能概括。2流式細(xì)胞儀的工作原理和技術(shù)指標(biāo)2. 1流式細(xì)胞儀工作原理除電源外，流式細(xì)胞儀主要由四部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)，其中流動(dòng)室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信 號(hào)的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸?shù)娜蝿?wù)。流動(dòng)室和液流系統(tǒng)流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計(jì)和 制作均很精細(xì)，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品， 單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；

5、鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流 速度u<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測(cè)細(xì)胞被限制在液流的軸線上。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到 振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。激光源和光學(xué)系統(tǒng)經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測(cè)。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以肥離子激光器為普遍,也有配和氟離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300400nm,很適合需要用紫外光激發(fā)的場(chǎng)合。瀛離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線最強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的

6、 80%;氟離子激光器光譜多集中在可見(jiàn)光部分,以647nm較強(qiáng)。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光 波長(zhǎng)在550nm以上，可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份，可使 原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用瀛離子激光器的綠光泵浦含有 Rhodamine6G水溶液的染料激光器 ，則可得到550650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4入f/ % Do人為激光波長(zhǎng)；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用

7、來(lái)選擇激光的波長(zhǎng)，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要 的波長(zhǎng)入。為了進(jìn)一步使檢測(cè)的發(fā)射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種濾 片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長(zhǎng)區(qū)段的光線濾除或通過(guò)。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC （Fluoresceinisothiocyanate,異硫氧熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過(guò)。長(zhǎng)波通過(guò)二向色性反射鏡只允許某一波長(zhǎng)以上的光線通過(guò)而將此波長(zhǎng)以下的另一特定波長(zhǎng)的光線反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各 種熒光分開(kāi)。光電管和檢測(cè)系統(tǒng)經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的

8、熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量 的。光電倍增管（PMT最為常用。PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為 ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在 200- 900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續(xù)調(diào)節(jié)，因此對(duì)弱光測(cè)量十分有利。光電管運(yùn)行時(shí)特別要注意穩(wěn)定性問(wèn)題，工作電壓要十分穩(wěn)定， 工作電流及功率不能太大。一般功耗低于 0.5W;最大陽(yáng)極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對(duì)光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理，并注意良好 的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT因?yàn)楣庾V響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好。從PMTB出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸

9、入分析儀器。流式細(xì)胞計(jì)中一般備有兩類 放大器。一類是輸出信號(hào)輻度與輸入信號(hào)成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范 圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過(guò)程的信號(hào)，例DNA測(cè)量等。另一類是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。因?yàn)樵诿庖叻治鰰r(shí)常要同時(shí)顯示 陰性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性三個(gè)亞群，它們的熒光強(qiáng)度相差12個(gè)數(shù)量級(jí)；而且在多色 免疫熒光 測(cè)量中，用對(duì)數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié)便利、細(xì)胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)。計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)經(jīng)放大后的電信號(hào)被送往計(jì)算機(jī)分析器。多道的道數(shù)是和電信號(hào)的脈沖高度相對(duì)應(yīng)的，也是和光 信號(hào)的

10、強(qiáng)弱相關(guān)的。對(duì)應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號(hào)的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目。多道分析器出來(lái)的信號(hào) 再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器 輸往微機(jī)處理器編成數(shù)據(jù)文件,或存貯于計(jì)算機(jī)的硬盤(pán)和軟盤(pán)上，或存于儀器內(nèi)以 備調(diào)用。計(jì)算機(jī)的存貯容量較大，可存貯同一細(xì)胞的68個(gè)參數(shù)。存貯于計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實(shí)測(cè)后脫機(jī)重現(xiàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，最后給出結(jié)果。除上述四個(gè)主要部分外，還備有電源及壓縮氣 體等附加裝置。2. 1. 1信號(hào)的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸在壓力作用下，鞘液管中的鞘液被持續(xù)不斷地壓入流動(dòng)室，形成一股穩(wěn)定地連續(xù)的液流，保證了樣本液穩(wěn)定地處于鞘液液流的軸線上，并以單個(gè)細(xì)胞形式直線通過(guò)激光照射區(qū)。激光照射區(qū)又稱測(cè)量區(qū)，是指液流與激光束垂直相

11、交的點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物（每種物質(zhì)攜帶的標(biāo)記物不同嗎？）通過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)部不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為 中心，向空間360。立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或固有參數(shù)。散射光又包括前向角散射和測(cè)向角散射。前向角散射與被測(cè)細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，測(cè)向角散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆 粒性質(zhì)的信息。熒光信號(hào)也有二種；一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出的微弱熒光信號(hào)，另一種是經(jīng)過(guò)特 異熒光素標(biāo)記后的細(xì)胞受激發(fā)照射后得到的熒光信號(hào)。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上波

12、長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開(kāi)。經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受到適合的光激發(fā)后產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。最常用的光電轉(zhuǎn)換器是光電倍增管（PMT。從PM陶出的電信號(hào)需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞儀中一般備有兩類放大器。一類是線性放大器，其輸出信號(hào)與輸入信號(hào)成線性關(guān)系。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過(guò)程的信號(hào)，如DNA測(cè)量等。另一類是對(duì)數(shù)放大器，其輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。放大后的電信號(hào)被傳送到計(jì)算機(jī)，再經(jīng)模一數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C(jī)處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存在計(jì)算機(jī)

13、上。保存在計(jì)算機(jī)上的數(shù)據(jù)可在脫機(jī)后再進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。參數(shù)（例如：細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)）測(cè)量原理流式細(xì)胞儀可同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，信息主要來(lái)自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。測(cè)量是在測(cè)量區(qū)進(jìn)行的，所謂測(cè)量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點(diǎn)。液流中央的單個(gè)細(xì)胞通過(guò)測(cè)量區(qū)時(shí)，受到激光照射會(huì)向立體角為2無(wú)（360° ）的整個(gè)空間散射光線，散射光的波長(zhǎng)和入射光的波長(zhǎng)相同。 散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因?yàn)檫@些生物學(xué)參數(shù)又和細(xì)胞對(duì)光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細(xì)胞對(duì)光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散

14、射光信號(hào)對(duì)不經(jīng)染色活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過(guò)固定的和染色處理的細(xì)胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號(hào)當(dāng)然不同于活細(xì)胞。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。在流式細(xì)胞術(shù) 測(cè)量中,常用的是兩種散射方向的散射光測(cè)量：前向角（即0角）散射（FSC）;側(cè)向散射（SS。，又稱90角散射。這時(shí)所說(shuō)的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說(shuō)來(lái)，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對(duì)同種細(xì)胞群體隨著細(xì)胞截面積的增大而增大；對(duì)球形活細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對(duì)于形狀復(fù)雜具有取向性

15、的細(xì)胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測(cè)量主要用來(lái)獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。在實(shí)際使用中，儀器首先要對(duì)光散射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時(shí)，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細(xì)胞。光散射測(cè)量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。熒光信號(hào)主要包括兩部分：自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長(zhǎng)也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號(hào)為噪

16、聲信號(hào)，在多數(shù)情況下會(huì)干擾對(duì)特異熒光信號(hào)的分辨和測(cè)量。在免疫細(xì)胞化學(xué) 等測(cè)量中,對(duì)于結(jié)合水平不高的熒光抗體來(lái)說(shuō)，如何提高信噪比是個(gè)關(guān)鍵。一般說(shuō)來(lái)，細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中所含亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：盡量選用較亮的熒光染料；選用適宜的激光 和濾片光學(xué)系統(tǒng)；采用電子補(bǔ)償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻(xiàn)予以補(bǔ)償。2. 1. 2流式細(xì)胞儀分選原理并不是所有的流式細(xì)胞儀都具有分選功能。流式細(xì)胞儀的分選功能是由細(xì)胞分選器來(lái)完成的。由噴嘴射出的液流

17、柱在電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)，斷裂形成均勻的小液滴。根據(jù)選定的 某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過(guò)靜 電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì)改變分選效果。從參數(shù)測(cè) 定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間。精確測(cè)定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，可根據(jù)具體要 求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。2. 1. 3數(shù)據(jù)的顯示和分析 數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析。單參數(shù)直方圖是使用最多的圖形顯示 形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。單參數(shù)直方圖是由X Y二方向組成的二維平面圖。橫座標(biāo)X是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度，用“道數(shù)”（Cha

18、nnel No.）來(lái)表示。選擇的放大器類型不同，標(biāo)度不同?？v座標(biāo)Y通常表示被測(cè)細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。正常情況下，數(shù)據(jù)分析得到的圖形為具有一個(gè)或若干個(gè)峰的曲線 圖。對(duì)曲線圖的解釋?xiě)?yīng)該具體問(wèn)題具體分析。除直方圖外，數(shù)據(jù)顯示方式還包括二維點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點(diǎn)圖也是比較常 用的數(shù)據(jù)顯示類型。它顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系，也是二維平面圖，橫縱坐標(biāo)可以根據(jù) 自己選定的被測(cè)參數(shù)自行決定，點(diǎn)的位置表明了細(xì)胞和顆粒具有的二個(gè)被測(cè)參數(shù)的數(shù)值。二維點(diǎn)圖所提供 的信息量要大于單參數(shù)直方圖。數(shù)據(jù)分析的方法大體可分為參數(shù)法和非參數(shù)法兩大類。當(dāng)被檢測(cè)的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型時(shí)則多 使用

19、參數(shù)方法。非參數(shù)分析法不用對(duì)顯示的圖像做任何假設(shè)，也不采用數(shù)學(xué)模型，分析程序可以很簡(jiǎn)單， 也可能很復(fù)雜。臨床醫(yī)學(xué)較常使用非參數(shù)分析法。2. 2流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個(gè)相鄰峰的最小距離，通常用變異系數(shù)（ CV值）來(lái)表示?，F(xiàn)在 市場(chǎng)上主流型號(hào)出廠時(shí)的熒光分辨率應(yīng)該小于2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測(cè)最小熒光光強(qiáng)的能力。一般用熒光微球上可測(cè)出的 FITC的最少分子數(shù)來(lái)表示。目前儀器均可達(dá)到1000左右。儀器工作時(shí)樣品濃度一般在105107細(xì)胞/ml。分析速度/分選速度是指流式細(xì)胞儀每秒種可分析或分

20、選的顆粒數(shù)目。一般分析速度為500010000,分選速度控制在 1000以下。流式細(xì)胞儀測(cè)量的數(shù)據(jù)是相對(duì)值，因此需要在使用前對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定。流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)有二個(gè)目 的，即儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。通常使用標(biāo)準(zhǔn)微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo) 準(zhǔn)樣品。3主流流式細(xì)胞儀型號(hào)及其特性介紹目前擁有市場(chǎng)較大份額的公司是美國(guó)的BD （Becton-Dickinson ）公司、Beckman-Coulter 公司（原名稱Coulter ）和德國(guó)的 Partec公司。3. 1 BD公司流式細(xì)胞儀介紹BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀都冠以FACs （fluorescence activated

21、cellsorter ）,即熒光激活細(xì)胞分選器。其型號(hào)種類比較齊全，如早期的 FACSort、FACS Canto、FACSean現(xiàn) 在市場(chǎng)上供應(yīng)的型號(hào)有五種：FACSCount（小型流式細(xì)胞儀）、FACSCAlibur （流式細(xì)胞儀）、FACSAia （流式細(xì)胞分選儀）、FACSVantage SETM （多色分析和高速分選流式細(xì)胞儀）、LSR II （數(shù)字化分析型流式細(xì)胞 儀）。FACSCount為精確計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞 CD3 CD4 CD8色對(duì)數(shù)而設(shè)計(jì)的。FACSCalibur是全自動(dòng)多色流式系統(tǒng)，偏重于臨床，其整體設(shè)計(jì)幫助臨床醫(yī)生快速實(shí)現(xiàn)常規(guī)免疫表型、CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)、DNA網(wǎng)織紅細(xì)胞、血

22、小板等臨床分析，兼具分選功能。配備有二根激光管，可同時(shí)檢測(cè)4個(gè)熒光參數(shù)?？勺R(shí)別粘聯(lián)細(xì)胞。BDFACSAria流式細(xì)胞分選儀為臺(tái)式高速細(xì)胞分選儀，獲取速度達(dá)70, 000細(xì)胞/s ,分析速度達(dá)50, 000/s。使用石英杯流動(dòng)檢測(cè)池固定光路校準(zhǔn)技術(shù)。使用三種激光，多色分析，分析參數(shù)可達(dá) 15色。兩管或四管分 選，可以使用多種規(guī)格的收集管。液流監(jiān)測(cè)系統(tǒng)白動(dòng)監(jiān)測(cè)液流斷點(diǎn)，檢查堵塞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分選的無(wú)人操 作。配件BDACDUI置，可以在微孔板或載波片上定量分選細(xì)胞。FACSV antage SETM是在FACSV antage的細(xì)胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強(qiáng)型流式細(xì)胞儀。六色熒光分析系統(tǒng)，點(diǎn)對(duì)點(diǎn)分

23、選，配置 FACSDiva數(shù)字化系統(tǒng)，提供全面的配套試劑。速度和功能優(yōu)于FACSVantage。BD LSR II是LSR的數(shù)字化升級(jí)版，其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之間，是專為生命科學(xué)研究設(shè)計(jì)的臺(tái)式機(jī)。配備固定校準(zhǔn)的紫外激光，四種激光立體空間激發(fā)、十色熒光同時(shí)分析、電子系統(tǒng)數(shù) 字化、比較易學(xué)易用。3. 2 Beckman-Coulter公司流式細(xì)胞儀介紹Beckman- Coulter公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀以 Profile （早期，現(xiàn)已停產(chǎn)）和EPICS系列為代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式細(xì)胞儀，目前市場(chǎng)上有

24、XL、XL-MCL和ALTRA三種型號(hào),其中ALTRAM有分選功能，適用于免疫學(xué)、細(xì)胞生理、分子生 物學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、水質(zhì)分析和植物細(xì)胞分析。Cytomics FC500系列流式細(xì)胞儀體積小，可自動(dòng)進(jìn)行5種顏色的分析，適用于免疫學(xué)檢測(cè)，如人類HIV診斷。特別是FC500MPL勺獨(dú)特設(shè)計(jì)可以在同一系統(tǒng)上 使用12X75mm的離心管和24或96孔的平板。特別適合工作量大的實(shí)驗(yàn)室。這二個(gè)公司主要針對(duì)醫(yī)學(xué)研究和臨床工作進(jìn)行設(shè)計(jì)和生產(chǎn)，其產(chǎn)品可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究以及臨床檢測(cè)的許多領(lǐng)域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多研究中紅細(xì)胞、T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定、檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞免疫測(cè)定等。這

25、二個(gè)公司的流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴，我國(guó)主要購(gòu)買(mǎi)、使用的單位基本上 都是一些醫(yī)療機(jī)構(gòu)。3. 3 Partec公司流式細(xì)胞儀介紹與BD和Becman-Coutler公司的產(chǎn)品相比，德國(guó) Partec公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀的共同特點(diǎn)是體積小，造價(jià)低，易操作，便于攜帶，適合植物學(xué)研究，適合邊遠(yuǎn)地區(qū)和發(fā)展中國(guó)家。德國(guó)Partec公司的產(chǎn)品分為三類：CCAa族、PAS家族和CyFlow家族(Galaxy為早期產(chǎn)品，已停產(chǎn))。CCAa族包括細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀 CC所口倍性分析儀PA-I。它是單或雙參數(shù)的臺(tái)式小型機(jī)，可以進(jìn)行一些常規(guī)分析，如核DNA測(cè)定(檢測(cè)倍性或細(xì)胞周期)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞凋亡。它的特點(diǎn)是體積小，易操作

26、，價(jià)格低，檢測(cè)范圍廣，可以檢測(cè)多種熒光素(如 PI、DAPI、Fluorescein )發(fā)出的熒光。PAS家族包括粒子分析系統(tǒng) PAS粒子分析系統(tǒng)III (PAS-III )和倍性分析儀PA-II o提供三種激光器的三種組合，可檢測(cè)十余種熒光 染料。最多可檢測(cè)和記錄八個(gè)獨(dú)立熒光參數(shù)。倍性分析儀PA能夠在2分鐘內(nèi)自動(dòng)測(cè)量植物的倍性水平，檢測(cè)異倍體。可以對(duì)葉片、幼苗、種子、果皮、根、花等植物材料進(jìn)行分析。在大多數(shù)植物中，異倍體染色體的檢測(cè)分辨率為± 1條染色體。PA-I使用HBO-100汞燈，屬于弧光燈，可產(chǎn)生紫外激發(fā)光和藍(lán)光。 PA-II 中增加了 488nm瀛離子激光器，能夠檢測(cè)幾乎

27、所有的熒光染料，如DAPI, Hoeehst, PI, EB, MMC FITC,FDA等。汞燈發(fā)光是電流經(jīng)過(guò)氣體時(shí)，氣體電離產(chǎn)生的。它能提供最佳的激發(fā)波長(zhǎng)。CyFlow (R) SL配備三種激光管，可應(yīng)用于諸如人類健康、微生物學(xué)、工業(yè)應(yīng)用、過(guò)程控制、生態(tài)學(xué)等研究。如HIV掃描中免疫標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)、食品處理過(guò)程中的微生物計(jì)數(shù)、細(xì)胞凋亡等。它使用 l2 V直流電， 特別適合邊遠(yuǎn)地區(qū)和發(fā)展中國(guó)家。國(guó)際上20世紀(jì)80年代開(kāi)始將流式細(xì)胞儀檢測(cè)應(yīng)用到植物的研究中( Galbraith ,1983),眾多學(xué)者都認(rèn)為 流式細(xì)胞儀是一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)DN給量的方法(Michaelson ,1991)。應(yīng)用范圍

28、主要是利用流式細(xì)胞儀研究屬內(nèi)、屬(多種植物的 DNA含量(Baird , 1994; Jacob, 1996; HALL, 2000)和倍性水平(Costich , 1993; Meng, 2002)、檢測(cè)體細(xì)胞雜種(Pfosser , 1995; Keller , 1996)和游離小抱子培養(yǎng)再生株( Kim, 2003)的DNA含量。過(guò)去我國(guó)應(yīng)用這一檢測(cè)技術(shù)的植物研究工作者寥寥無(wú)幾，且大多是在國(guó)外實(shí)驗(yàn)室完成的。研究?jī)?nèi)容包括植物生理、程序性死亡、倍性鑒定等。植物研究中使用的流式細(xì)胞儀基本上都是Partec公司的產(chǎn)品，也有少量是BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀。BD公司的產(chǎn)品主要定位于醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用，

29、與Partec 產(chǎn)品相比，不太適合從事植物染色體倍性的鑒定。 主要體現(xiàn)在不能提供植物樣品制備技術(shù) /試劑，數(shù)據(jù)獲取 軟件可同時(shí)檢測(cè)到的倍性數(shù)目少。鑒于目前我國(guó)科研院所中使用較多的是 BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀，在下 一篇中將會(huì)對(duì)利用BD流式細(xì)胞儀進(jìn)行植物倍性檢測(cè)的技術(shù)和技巧做詳細(xì)報(bào)告。如何選擇流式細(xì)胞儀自七十年代出現(xiàn)第一代流式細(xì)胞儀以來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、電子制造技術(shù)、激光技術(shù)及熒光素合成技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代流式細(xì)胞儀已今非昔比，制造工藝、功能、精確度有了質(zhì)的飛躍。流式細(xì)胞儀生產(chǎn)廠商推出各種不同型號(hào)的流式細(xì)胞儀來(lái)滿足用戶的不同需要。現(xiàn)生產(chǎn)流式細(xì)胞的廠商全球 至少有六家，各廠商產(chǎn)品又有不同的系列，各

30、具特點(diǎn)。如何從眾多的型號(hào)中挑選出最適合自己的機(jī)型，我 們還需從分析應(yīng)用出發(fā)，評(píng)估自己的需求來(lái)決定什么樣的流式細(xì)胞儀最具性價(jià)比、最適合自己。、DNA倍體分析DNA分析是流式細(xì)胞儀最初且是現(xiàn)在應(yīng)用最廣檢測(cè)項(xiàng)目。由于惡性細(xì)胞DNA含量通常與正常細(xì)胞不同，存在異倍體細(xì)胞，所以現(xiàn)有很研究評(píng)價(jià)異倍體細(xì)胞與腫瘤惡性度及其預(yù)后的關(guān)系。DNA含量檢測(cè)還可提供細(xì)胞周期方面的信息，這在細(xì)胞生物學(xué)中運(yùn)用很廣泛。特別地，它可表示出細(xì)胞毒性藥物對(duì)細(xì)胞作用過(guò)程。這些DNA測(cè)還可與細(xì)胞表面標(biāo)志物標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行，這樣在細(xì)胞混合培養(yǎng)中，可通常追蹤表達(dá)特異標(biāo)志物的細(xì)胞顯示其生長(zhǎng)周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學(xué)反應(yīng)并

31、發(fā)射出熒光，常用的染料為 PI , DAPIo流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，575nm濾光片。、細(xì)胞生存能力實(shí)驗(yàn)使用Heochest 33342染料與DNA#異性結(jié)合，后因細(xì)胞活力不同，染料的結(jié)合程度也各異，故可評(píng)估細(xì)胞的活性度。流式細(xì)胞儀要求：360nm光源，455nm濾光片。、計(jì)數(shù)外周血中檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞使用TO染料能夠特異性地與 RNA吉合，結(jié)合系數(shù)高達(dá) 3000,故具有很好的性價(jià)比。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，525nm濾光片，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)。、外周血、骨髓采集物中CD34陽(yáng)性干細(xì)胞計(jì)數(shù)，臨床上用于骨髓移植前干細(xì)胞數(shù)理的測(cè)定使用標(biāo)準(zhǔn)ISHAG方案，需要DNA其他核染料占用 FIT

32、C通道，PE標(biāo)記CD3做體，PE-CY5標(biāo)記CD45a體。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，525nm 575nnr 675nm濾光片，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)。、交叉淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)識(shí)別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細(xì)胞之間是否存在反應(yīng)有著重要臨床意義，因?yàn)檫@種反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致 移植后發(fā)熱、移植后肺損傷及免疫性粒細(xì)胞缺乏癥。流式細(xì)胞儀可檢測(cè)全血樣本與血清孵育后粒細(xì)胞上結(jié) 合的人免疫球蛋白。FITC標(biāo)記人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記粒細(xì)胞表面標(biāo)志物、PE-CY5標(biāo)記HLA抗體。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，525nm 575nnr 675nm濾光片。、血小板自身抗體檢測(cè)血小板自身抗體識(shí)別人血小板抗原，會(huì)

33、引起各種臨床相關(guān)癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫瘢、難治性血小板減少。流式細(xì)胞可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)血小板自身抗體。FITC標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記識(shí)別血小板抗體。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，525nm 575nm濾光片。、移植交叉配型原細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，主要用于避免移植物超急性排拆反應(yīng)。流式細(xì)胞儀用于監(jiān)測(cè)T或B細(xì)胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為 HLA配型前的預(yù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀因其高精確性已成為該領(lǐng)域內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)。FITC標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記識(shí)別T細(xì)胞CD3或B細(xì)胞CD29抗體。儀器要求：488nm光源，525nm 575nm濾光片。、檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)抗原或細(xì)胞有絲分裂

34、刺激后活化效應(yīng)淋巴細(xì)胞早期活化指標(biāo) CD69可用來(lái)檢測(cè)免疫治療效果。流式細(xì)胞使用三色分析可監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞各亞群活化情況：FITC標(biāo)記的CD咖體、PE標(biāo)記的CD8抗體、PE-CY5標(biāo)記的CD69抗體。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，525nm 575nnr 575nm濾光片。、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子（TH1/TH2細(xì)胞檢測(cè)）未活化的淋巴細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子極少，用流式細(xì)胞儀很難檢測(cè)出來(lái)，因此在檢測(cè)前需刺激活化?；罨玫拇碳に貫?PMA佛波酯+Ionomycin。淋巴細(xì)胞在刺激素的作用下，活化分泌細(xì)胞因子到細(xì)胞外。因流式細(xì)胞儀只能對(duì)細(xì)胞表面或內(nèi)部的抗原進(jìn)行檢測(cè)，如細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外則檢測(cè)不到，因此必須阻

35、止細(xì)胞因子的分泌。抑制細(xì)胞因子分泌的試劑為Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2細(xì)胞首先是 CD4+TI田胞，因此存在著用CD4來(lái)設(shè)定細(xì)胞群的問(wèn)題。我們知道CD4不但在T細(xì)胞上表達(dá)，還在所有的單核細(xì)胞上表達(dá)，因此單獨(dú)用CD4設(shè)門(mén)無(wú)法將CD4+T細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。那么我們用CD3和CD4雙參數(shù)設(shè)門(mén)是否可以呢？回答是否定的。因?yàn)樵诜鸩サ拇碳ぷ饔孟翪D4抗原的表達(dá)會(huì)迅速下調(diào)，甚至完全喪失，所以不適合于設(shè)門(mén)。用CD3和CD8設(shè)門(mén)，因CD8不受佛波脂的影響且絕大多數(shù)CD3+CD8的細(xì)胞都是 CD3+CD4+胞，因此可用CD3+CD8細(xì)胞群來(lái)確定 CD4+T細(xì)胞群。FITC 標(biāo)記 CD8 PE標(biāo)記 IL-4 和，PE-CY5標(biāo)記 IFN-r , APCM PE-CY7 標(biāo)記CD3流式細(xì)胞儀要求：488nm或633nm （僅限APCfe料）光源，525nnr 575nm 675nm. 767nm濾光片。（10）、細(xì)胞增殖狀態(tài)檢測(cè) 核增殖抗PCNA Ki67、BrdUrd用于衡量細(xì)胞增殖分裂狀況，在評(píng)估腫瘤預(yù)后有重要意義。為些標(biāo)志物的檢測(cè)一般同細(xì)胞表面標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)。FITC標(biāo)記PCNA Ki67或BrdUrd , PE或(并)PE-CY5標(biāo)記細(xì)胞表面標(biāo)志物。流式細(xì)胞儀要求： 488nm或633nm光源，525nm 575nnr 675nm濾光片。(11)、染色體分