水產(chǎn)食品有毒有害物質(zhì)檢測方法綜述重點

1、水產(chǎn)品中常見污染物質(zhì)及其檢測方法的研究1、前言水產(chǎn)品加工是指以海水、淡水產(chǎn)的魚類、貝類、蝦蟹類等水產(chǎn)品為主體，加工制造成各類食品、飼料和工業(yè)、醫(yī)藥等用品。我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)、貿(mào)易和消費大國，漁業(yè)是農(nóng)業(yè)和國民經(jīng)濟(jì)的重要產(chǎn)業(yè)，因此水產(chǎn)品的質(zhì)量安全是國民健康消費的基礎(chǔ)。目前我國水產(chǎn)品中存在的污染主要是：微生物污染,主要是水產(chǎn)品自身所攜帶的病原菌和寄生蟲；化學(xué)有機(jī)物污染，主要是由于人類活動所造成的污染，如濫用藥物、飼料以及污水排放等； 物理污染，主要是指一些重金屬離子之類的。2、污染介紹2.1微生物污染水產(chǎn)品的微生物污染可分為一次性污染和二次性污染。一次性污染是指魚蝦貝類遭受自然界微生物感染發(fā)病,從而導(dǎo)

2、致魚蝦貝類自身的污染。二次性污染是指來自自然環(huán)境污染,其中包括魚蝦貝類捕獲后的污染,二次污染的微生物主要包括病原微生物和腐敗微生物。2.1.1弧菌副溶血性弧菌是引起食源性疾病的主要病原菌之一，也是我國沿海食物中毒和夏季腹瀉的重要病原菌。河流弧菌是一種嗜鹽菌，廣泛存在于河流或出海口水中，抵抗力較強(qiáng)，是世界范圍內(nèi)海水魚類和貝類養(yǎng)殖的主要威脅之一，是引起鮑魚死亡的主要病原菌?；魜y弧菌是引起烈性傳染病霍亂的病原體，自 1817 年以來，已發(fā)生過 7 次世界性霍亂大流行，主要發(fā)生在夏、秋季節(jié)。創(chuàng)傷弧菌是人和動物共患病的重要致病菌，在醫(yī)學(xué)界和魚病學(xué)界都廣為重視。按寄主范圍和生化反應(yīng)類型可劃分為生物 1 型

3、和生物 2 型兩個生物型。2.1.2沙門氏菌沙門氏菌廣泛存在于自然界中，是主要食源性病原微生物之一，在我國，以沙門氏菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的首位。動物性食品是引起沙門氏菌食物中毒的主要食品，魚貝蝦類水產(chǎn)品是其中之一。2.1.3大腸桿菌大腸桿菌是一個很大的菌屬，包括致病性和非致病性大腸桿菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的微生物。多年來，致病性大腸桿菌中的致瀉性大腸桿菌引起的腹瀉病例一直位于第二，大腸桿菌很容易隨污水傳播，所以一旦檢出大腸桿菌,即意味著直接或間接地被糞便污染。2.1.4嗜水氣單胞菌嗜水氣單胞菌屬于弧菌科、氣單胞菌屬，是嗜溫、有動力的氣單胞菌群，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞

4、便中，對水產(chǎn)動物、畜禽和人類均有致病性，是一種典型“人獸魚”共患病病菌，各種淡水魚都可感染，人類可因致病性嗜水氣單胞菌感染而發(fā)生腹瀉、食物中毒和繼發(fā)感染。2.1.5遲鈍愛德華氏菌遲鈍愛德華氏菌是目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有極大危害的病原菌，迄今，該菌已在二十多種魚類養(yǎng)殖中引發(fā)了病害，造成了巨大損失。另外，它是愛德華氏菌屬中唯一感染人的成員。比較容易感染本來已患有肝炎和腫瘤疾病的人群，還可引起人的腦膜炎、肝膿腫、蜂窩組織炎、骨髓炎和敗血癥等。2.2化學(xué)有機(jī)物污染2.2.1孔雀石綠孔雀石綠是有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，既是染料，也是殺菌和殺寄生蟲的化學(xué)制劑，對魚體水霉病和魚卵的水霉病有特效?？兹甘G進(jìn)入水生動物

5、體內(nèi)后，會快速代謝成脂溶性的無色孔雀石綠?？兹甘G具有潛在的致癌、致畸、致突變的作用。2.2.2氯霉素氯霉素在生物醫(yī)學(xué)中屬于抗生素種類之一，對病原菌能夠起到抑制生長的作用。但是其對水產(chǎn)品的肌肉組織生長具有一定的毒性、副作用。因此，國家將其列入獸藥的禁用行列中，并對其在產(chǎn)品中殘留量進(jìn)行檢測，以確保水產(chǎn)品的衛(wèi)生安全。2.2.3硝基呋喃硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，它們作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類的代謝，從而起抑菌作用。曾今廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，后來發(fā)現(xiàn)它們對人體有致癌、致畸胎副作用，就被禁止使用了。2.2.4組織胺水產(chǎn)品中的組胺主要是魚肉在腐敗過程中其機(jī)體中的組氨酸通過其中存

6、在的微生物所產(chǎn)生的組氨酸脫羧酶的脫羧作用而生成。組胺中毒是水產(chǎn)食品存在的主要安全問題之一，全國各地尤其是沿海地區(qū)組胺中毒事件時有發(fā)生。當(dāng)有機(jī)體攝入組胺超過100 mg(或每千克體質(zhì)量 1.5 mg)時，即可引起過敏性食物中毒，口服 840 mg 組胺將引起輕微中毒癥狀，超過 40 mg 產(chǎn)生中等中毒癥狀如果超過 100 mg 將產(chǎn)生嚴(yán)重中毒癥狀。2.2.5DDT及其衍生物DDT是一種殺蟲劑，也是一種農(nóng)藥，為白色晶體，無味無嗅，不溶于水，溶于煤油。上世紀(jì)風(fēng)靡一時。后來經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，由于其在環(huán)境中非常難降解，并可在動物脂肪內(nèi)蓄積，對環(huán)境污染過于嚴(yán)重，因此很多國家和地區(qū)已經(jīng)禁止使用。2.3物理污染2.

7、3.1砷砷可以通過食物鏈在水生生物體內(nèi)富集，水生生物對砷有很強(qiáng)的富集能力，長期食用砷污染的水產(chǎn)品會導(dǎo)致砷在人體內(nèi)蓄積，造成慢性或急性中毒。慢性中毒表現(xiàn)為疲勞、乏力、心悸、驚厥；急性中毒表現(xiàn)為口腔有金屬味，口、咽、食道有燒灼感，惡心、劇烈嘔吐、腹瀉，體溫和血壓下降，重癥病人煩躁不安，四肢疼痛。砷還能引起皮膚損傷，出現(xiàn)角質(zhì)化、蛻皮、脫發(fā)、色素沉積等，有時會誘發(fā)惡性腫瘤。2.3.2鉛食用受污染的水產(chǎn)品會使鉛進(jìn)入到人體，人體中的鉛通過與多種酶結(jié)合從而干擾有機(jī)體多方面的生理活動，對全身器官產(chǎn)生危害，特別是對人體神經(jīng)系統(tǒng)、血液和心血管系統(tǒng)等造成損害。無機(jī)鉛干擾血紅蛋白的重要組成部分與亞鐵血紅素合成酶，導(dǎo)致

8、貧血癥。金屬鉛可引起神經(jīng)細(xì)胞壞死、髓鞘退化，還可以引起由于腦脊髓液壓力升高而導(dǎo)致的腦血管損傷。有機(jī)鉛化合物容易通過上皮組織大量吸收，導(dǎo)致腦部疾病和孩童智力損傷。2.3.3汞水環(huán)境中的無機(jī)汞可被厭氧生物轉(zhuǎn)化為毒性強(qiáng)的甲基汞，甲基汞具有脂溶性，可被微生物吸收積累并轉(zhuǎn)入食物鏈對人體產(chǎn)生危害。甲基汞可以透過血腦屏障，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害，導(dǎo)致神經(jīng)受損或肌肉運動不協(xié)調(diào)、顫栗、癲癇發(fā)作等，也會造成腎損傷；甲基汞對發(fā)育中的胚胎和幼兒的神經(jīng)系統(tǒng)危害更大，孕婦和幼兒等敏感人群應(yīng)該避免食用甲基汞含量高的水產(chǎn)品。2.3.4鎘在日本，鎘污染事件曾造成過轟動一時的“痛痛病”。人體內(nèi)的鎘在體內(nèi)半衰期可能長達(dá) 30 年，

9、在骨骼、肝、腎、脾、胰等器官中都會有蓄積。鎘與含羥基、氨基、巰基的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，能使許多酶系統(tǒng)受到抑制，從而影響肝、腎器官中酶系統(tǒng)的正常功能，使組織代謝產(chǎn)生障礙，對人體有“三致”（致癌、致畸、致突變）毒性。3檢測方法3.1微生物檢測方法3.1.1免疫學(xué)檢測技術(shù)免疫熒光技術(shù)是利用某些熒光素通過化學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合制成熒光抗體,熒光抗體與被檢抗原特異性結(jié)合后,形成的免疫復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光,借助熒光顯微鏡可檢測或定位被檢抗原。免疫熒光技術(shù)將免疫化學(xué)和血清學(xué)的高度特異性和敏感性與顯微術(shù)的高度精確性相結(jié)合, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖病原的檢測上得到一定應(yīng)用。免疫酶技術(shù)利用了抗原-抗體反應(yīng)的高度

10、特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性,通過肉眼或顯微鏡觀察及分光光度計測定,達(dá)到在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的部位,以及對其進(jìn)行定量的目的。可分為固相、均相和雙抗體酶免疫測定技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是目前應(yīng)用最廣泛的固相免疫酶測定技術(shù)。免疫磁珠分離法可將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面,與樣品中被檢致病微生物發(fā)生特異性結(jié)合,載有致病微生物的磁性微球在外加磁場的作用下向磁極方向聚集，因此可特異性地將目的微生物從樣品中快速分離出來。3.1.2核酸檢測技術(shù)核酸雜交是利用特異性的標(biāo)記 DNA 片段為指示探針,與其互補鏈退火雜交,從而達(dá)到檢查核酸樣品中特定基因序列的檢測。核酸雜交技術(shù)具有靈敏度高、

11、特異性強(qiáng)、診斷速度快和操作較為簡單等優(yōu)點, 它對流行性爆發(fā)病的診斷并制定及時的方案, 以及抗特種病原的動物育種等方面可提供可靠實用的依據(jù), 具有極高的應(yīng)用價值。PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序列的方法,也稱無細(xì)胞克隆系統(tǒng)。該方法可使極微量的目的基因或特定的 DNA 序列在短短幾個小時內(nèi)擴(kuò)增至百萬倍。當(dāng)我們知道待檢病原具有某一特定基因片段時, 即可利用特異的引物對樣品中微量的目標(biāo) DNA進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,通過電泳檢測擴(kuò)增出的特定片段, 即可確定感染的病原。DNA 指紋技術(shù)是指限制性酶消化產(chǎn)物在電泳圖譜或 Southern 雜交中產(chǎn)生的一系列帶紋, 不同帶紋代表

12、了在染色體不同位置上的不同長度的 DNA 序列。目前在病原微生物檢測上應(yīng)用的 DNA 指紋技術(shù)主要包括限制性片段長度多態(tài)性, 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA等技術(shù)。16S rRNA(rDNA)基因為所有生物體生存所必需的基因序列并且也是較保守的序列之一。16S rRNA (rDNA)基因的序列檢測已被成功地建立為一種鑒定微生物種、屬、家族種類的標(biāo)準(zhǔn)方法。同時,由于種間 16S rRNA(rDNA)基因之間的間隔區(qū)在長度、序列上具有相對多變性,利用 16S 及 23S rRNA(rDNA)基因中的保守區(qū)為引物,對此間隔區(qū)進(jìn)行克隆和分析，就能為病原微生物各種菌株、種、屬的鑒定、分型提供

13、依據(jù)。3.1.3基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是將各種基因寡核苷酸點樣于芯片表面,微生物樣品 DNA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，再與芯片上寡核苷酸點雜交，最后通過掃描儀定量并分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特定微生物?；蛐酒夹g(shù)可以對環(huán)境中的微生物實現(xiàn)高通量和并行檢測。它在理論上可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病原，可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學(xué)指標(biāo)，同時具有靈敏、特異和快速便捷等優(yōu)點,因而在致病微生物檢測中有很好的發(fā)展前景。3.2有機(jī)化合物檢測方法3.2.1孔雀石綠檢測高效液相色譜紫外檢測法：孔雀石綠在水產(chǎn)品體內(nèi)可被代謝為無色孔雀石綠，所以魚體內(nèi)同時殘留孔雀石綠以

14、及無色孔雀石綠。孔雀石綠肉眼可見，水溶液顯藍(lán)綠色，可被可見光分光光度計或者高效液相色譜的紫外光檢測器測定(檢測波長618 nm)。高效液相色譜熒光檢測法：無色孔雀石綠肉眼不可見，水溶液顯無色，但是無色孔雀石綠具有熒光特性，因此可用熒光分光光度計或者高效液相色譜的熒光檢測器測定(激發(fā)波長265nm；發(fā)射波長360 nm)國標(biāo) GB / T203612006是在樣品前處理過程中加入硼氫化鉀，將孔雀石綠還原成無色孔雀石綠，再通過熒光檢測器進(jìn)行測定。高效液相色譜紫外和熒光檢測器同時檢測法：針對實際操作中可能會出現(xiàn)孔雀石綠不易完全被硼氫化鉀還原為無色孔雀石綠的情況，可以將紫外檢測器和熒光檢測器串聯(lián)起來使

15、用，這樣無色孔雀石綠可以用熒光檢測器檢測；沒有被還原的孔雀石綠可以被紫外檢測器檢測出來，最后將兩者一起定量。3.2.2氯霉素檢測發(fā)光細(xì)菌法: 發(fā)光細(xì)菌與外來毒物接觸后會對發(fā)光細(xì)菌細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度。發(fā)光細(xì)菌法就是利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度或抑菌圈的大小與毒物濃度之間的關(guān)系來定量或定性分析樣品中毒物濃度的新型檢測方法，該方法操作方便、靈敏度高、檢測快速。色譜和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù): 隨著接口技術(shù)的成熟，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)品CAP藥物殘留分析中。該技術(shù)既保留了色譜的高分離能力、高分析速度、高靈敏度，又結(jié)合了質(zhì)譜對化合物的強(qiáng)結(jié)構(gòu)鑒定能力，提高了檢測的選擇性和靈敏度。然而

16、因色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀價格昂貴而限制了該方法在一般實驗室的普及應(yīng)用。免疫分析法: 酶聯(lián)免疫吸附分析方法具有簡單、快速、靈敏和花費低等特點，包括板式檢測、試紙條檢測和儀器免疫法等，常被用于水產(chǎn)品中CAP藥物的快速檢測方法的建立。磁減量檢測法：磁減量檢測法是利用帶有生物探針的納米磁珠與待測物分子結(jié)合后，使磁珠聚集變大變重，再通過測定納米磁珠磁性大小的改變情況，進(jìn)而得出待測物分子濃度的新型檢測方法。與傳統(tǒng)的免疫分析法相比，該方法免洗、操作簡單、特異性好且只需要一種抗體。傳感器檢測法：傳感器檢測方法是檢測方法研究的熱點。按照檢測原理的不同，可以分為：熒光傳感器、光化學(xué)傳感器、化學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器、表面

17、等離子共振傳感器等。但是，傳感器檢測方法的低重現(xiàn)性問題依然有待解決。3.2.3硝基呋喃檢測高效液相色譜法:它是當(dāng)前檢測硝基呋喃類藥物代謝物最常用的方法之一。其基本過程是將組織樣品粉碎后利用有機(jī)試劑或者其它方法去除水分,再進(jìn)行洗脫、濃縮, 有時在高脂樣品中采用正己烷去脂,流動相溶解,凈化后上機(jī)檢測。通常高效液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定硝基呋喃類抗生素,但是呋喃結(jié)構(gòu)在紫外光譜區(qū)吸收不明顯,因而靈敏度過低,很難達(dá)到檢測要求。超高效液相色譜法：它的靈敏度和分離度比高效液相色譜高，一般在多殘留檢測時應(yīng)用。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法：近年來,高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù)測定硝基呋喃類代謝物在動物組織中的殘留檢測越來越廣

18、泛應(yīng)用。許多科研機(jī)構(gòu)實驗室也均能夠承擔(dān)起該儀器的使用費用。同時,與高效液相色譜相比,質(zhì)譜檢測器較紫外檢測器具有不可比擬的優(yōu)勢。其具有定性、定量準(zhǔn)確、測定速度快、檢出限低、強(qiáng)抗干擾能力, 還能避免 HPLC 測定中出現(xiàn)的假陽性問題。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：目前已經(jīng)成為各國確定硝基呋喃類代謝物的驗證方法。LC-MS/MS 相比于LC-UV 和 LC-MS 得到了技術(shù)上的突破,檢測限低,線性范圍寬,為實現(xiàn)硝基呋喃類藥物的檢測控制提供了技術(shù)支撐。酶聯(lián)免疫法：它的提出和實現(xiàn)使得檢測更加快捷。能夠?qū)崿F(xiàn)高精度、高靈敏、高特異性和大批量檢測。缺陷是ELISA 法假陽性率高,且不能實現(xiàn)在線檢測。其測定原理是抗

19、原抗體的反應(yīng)(雙抗體反應(yīng))。3.2.4組織胺檢測薄層層析法，熒光法，液相色譜法以及正戊醇提取稀鹽酸反萃取法。3.3物理污染物檢測原子吸收光譜法：該方法是利用蒸氣相中被測金屬元素的基態(tài)原子對其原子共振額射的吸收而建立的，具有靈敏度高、檢測限低、精確度好，分析快速的特點，是現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥環(huán)保等行業(yè)不可缺少的分析方法。原子熒光光譜法：在福射能的激發(fā)下，金屬元素的原子蒸氣可產(chǎn)生一定的焚光強(qiáng)度，通過焚光強(qiáng)度即可測定待測元素的含量，原子突光光譜法就是基于這一原理而建立起來的。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法：利用高頻感應(yīng)電流來產(chǎn)生高溫，反應(yīng)氣經(jīng)過加熱、電離、激發(fā)等程序能檢測到特征性光譜線，且譜線的強(qiáng)度與元

20、素含量成正比，以此可進(jìn)行定量分析。此法線性范圍較寬，具有干擾小，靈敏性好的特點，不僅可對高溫金屬元素進(jìn)行快速分析，而且還能實現(xiàn)對多種金屬元素的或同時分析。電感耦合等離子體質(zhì)譜法：以電感耦合炬作為金屬元素的原子化器和離子化器，試樣在等離子體中被離子化，然后電離了的試樣經(jīng)過接口被引入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)量分析，經(jīng)檢測記錄從而獲得質(zhì)譜圖。電化學(xué)法：與光譜法和質(zhì)譜法相比，電化學(xué)法無需昂貴的儀器，其操作簡單，檢測成本較低，對試樣的組分、形態(tài)和價態(tài)都能進(jìn)行分析，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速的特點，適合于自動、連續(xù)、實時的檢測分析。前用于重金屬檢測的電化學(xué)法主要包括伏安法和示波極譜法。4、看法及建議我國水產(chǎn)品產(chǎn)量高，消費量

21、也高，因此其安全性必然要受到重視。我們列舉了常見的毒害物質(zhì)，以及檢測方法。從有機(jī)到無機(jī)，從生物到非生物。應(yīng)用的方 法幾乎也是目前流行的方法。另外，我們需要制定更為嚴(yán)格的污染物控制標(biāo)準(zhǔn)，同時也要發(fā)展科技，研究新型的儀器設(shè)備，來更準(zhǔn)確的檢測有毒有害物質(zhì)。5、參考文獻(xiàn)1段效輝,王穎,曹鵬,李金慶,魯閩,劉寧. 發(fā)光細(xì)菌在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用研究進(jìn)展J. 化學(xué)與生物工程,2016,10:8-11.2邢麗紅,冷凱良,孫偉紅,李兆新,苗鈞魁,翟毓秀. 高效液相色譜-紫外檢測法測定水產(chǎn)品中組胺的含量J. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,13:7832-7834+7863.3柯常亮,劉奇,王許諾,陳潔文,王增煥,林頌雄,蔡楠,黃珂,程波,李劉冬. 氣相色譜法同時測定水產(chǎn)品中28種多氯聯(lián)苯同系物J. 食品與發(fā)酵工業(yè),2015,07:155-159.4周倩