病毒的分離鑒定學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1病毒的分離鑒定病毒的分離鑒定第一頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分?！叭汤滏溔汤滏湣钡?頁(yè)/共21頁(yè)第二頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。1 1動(dòng)物接種動(dòng)物接種動(dòng)物分離病毒法：乳小白鼠（動(dòng)物分離病毒法：乳小白鼠（3日齡）日齡）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：很敏感，易掌握；病毒可隨傳代次數(shù)的增加而增強(qiáng)，有利于病毒分離；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：小白鼠本身存在多種病毒性疾病，往往會(huì)影響結(jié)果；小鼠也可能存在個(gè)體差異；接種途徑：接種途徑：腦內(nèi)接種腦內(nèi)接種皮下接種皮內(nèi)接種腹腔接種肌肉接種靜脈接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察：動(dòng)物的發(fā)育、活動(dòng)力、食欲和糞便特殊癥狀：震顫、弓背、不安、嗜睡、癱瘓、抽搐等直至死亡有些實(shí)驗(yàn)還需

2、測(cè)量動(dòng)物的體溫和體重第2頁(yè)/共21頁(yè)第三頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。（1）原代和次代細(xì)胞培養(yǎng) （2）二倍體細(xì)胞培養(yǎng) （3）傳代細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng) （4）病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 1）細(xì)胞病變 2）紅細(xì)胞吸附 3）干擾現(xiàn)象 4）細(xì)胞代謝的改變 組織培養(yǎng)分離法：組織培養(yǎng)分離法：沒(méi)有隱性感染沒(méi)有隱性感染沒(méi)有免疫能力的抵抗力沒(méi)有免疫能力的抵抗力接種量大接種量大培養(yǎng)條件易于控制培養(yǎng)條件易于控制加速病毒的分離過(guò)程加速病毒的分離過(guò)程漢坦病毒敏感的培養(yǎng)細(xì)胞漢坦病毒敏感的培養(yǎng)細(xì)胞l首先發(fā)現(xiàn)人肺癌細(xì)胞（A549）l其他敏感細(xì)胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等2 2組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)第3頁(yè)/共2

3、1頁(yè)第四頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。細(xì)胞病變（細(xì)胞病變（CPE ）：）：1、分布均勻的小顆粒狀破壞病變；2、局灶狀小顆粒狀破壞；3、細(xì)胞圓化，呈局灶性葡萄狀的堆積；4、細(xì)胞融合。圓縮；脫落；聚集；破碎；第4頁(yè)/共21頁(yè)第五頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。3雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：對(duì)大多數(shù)病毒均較敏感，其病毒繁 殖量較高； 來(lái)源方便、經(jīng)濟(jì)，管理方便；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作不當(dāng)污染，導(dǎo)致胚胎死亡；4蚊蟲(chóng)分離病毒法蚊蟲(chóng)分離病毒法經(jīng)口感染經(jīng)口感染胸腔接種胸腔接種優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：病毒可長(zhǎng)時(shí)間保存在蚊體內(nèi)； 蚊蟲(chóng)飼養(yǎng)較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物容易，數(shù) 量大；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：必須經(jīng)常了解蚊子體內(nèi)是否確 已帶毒；第5頁(yè)/共

4、21頁(yè)第六頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。第6頁(yè)/共21頁(yè)第七頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。1）蝕斑（蝕斑（plaque）測(cè)定）測(cè)定 可進(jìn)行病毒的分離純化； 蝕斑形成單位（plaque forming unit, PFU） 2）50%感染量或感染量或50%組織感染量（組織感染量（ID50或或TCID50）測(cè)定）測(cè)定（一）（一）病毒的數(shù)量與感染性測(cè)定病毒的數(shù)量與感染性測(cè)定 二、病毒的鑒定結(jié)晶紫染色中性紅染色第7頁(yè)/共21頁(yè)第八頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。 1）病毒核酸類(lèi)型的測(cè)定）病毒核酸類(lèi)型的測(cè)定 2）理化性狀的檢測(cè)：大小及結(jié)構(gòu)、衣殼對(duì)稱(chēng)類(lèi)型、有無(wú)包膜等）理化性狀的檢測(cè)：大小及

5、結(jié)構(gòu)、衣殼對(duì)稱(chēng)類(lèi)型、有無(wú)包膜等 3）血清學(xué)鑒定）血清學(xué)鑒定 ELISA；IFA；（二）（二）病毒理化性質(zhì)及血清學(xué)鑒定病毒理化性質(zhì)及血清學(xué)鑒定第8頁(yè)/共21頁(yè)第九頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。陽(yáng)性分離物上清陽(yáng)性分離物上清提取總提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成反轉(zhuǎn)錄合成cDNA直接測(cè)序或克隆測(cè)序直接測(cè)序或克隆測(cè)序PCR擴(kuò)增擴(kuò)增（三）（三）病毒分子生物學(xué)鑒定病毒分子生物學(xué)鑒定第9頁(yè)/共21頁(yè)第十頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。什么是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)什么是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)n聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是一種在體外特異地?cái)U(kuò)增已知基因的方法；是

6、一種在體外特異地?cái)U(kuò)增已知基因的方法；由由K. Mullis于于1983年建立年建立；可用于分析基因及其產(chǎn)物的水平變化；可用于分析基因及其產(chǎn)物的水平變化；可進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量分析可進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量分析；可結(jié)合免疫沉淀的方法確定蛋白質(zhì)與可結(jié)合免疫沉淀的方法確定蛋白質(zhì)與DNA序列的序列的相互作用。相互作用。 第10頁(yè)/共21頁(yè)第十一頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理PCR操作過(guò)程操作過(guò)程1、預(yù)變性（預(yù)變性（Initial denaturation）：）： 模板DNA完全變性對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，一般95加熱3-5分鐘；2、引物退火（引物退火（Primer annea

7、ling）：）：退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)決定，退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響；3、引物延伸（引物延伸（Primer elongation）：）：引物延伸一般在72 進(jìn)行（Taq酶最適溫度），延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定；4、循環(huán)中的變性步驟：循環(huán)中的變性步驟：循環(huán)中一般95，30秒足已使各種靶DNA序列完全變性，變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失??；5、循環(huán)數(shù)：循環(huán)數(shù)：大多數(shù)PCR含25-35個(gè)循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異條帶；6、最后延伸：最后延伸：在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72 維持5-15分鐘，使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。第11頁(yè)/共21頁(yè)第十二頁(yè)，編輯于

8、星期日：十八點(diǎn) 二十二分。PCR的各種變體的各種變體反向PCR（Inverse PCR，IPCR）不對(duì)稱(chēng)PCR（Asymmetric PCR）多重PCR熒光定量PCR（Q-PCR）反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）巢式PCR（NEST PCR）遞減PCR（Touchdown PCR）第12頁(yè)/共21頁(yè)第十三頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分?？捎糜诳捎糜趍RNA的半定量分析的半定量分析 反 轉(zhuǎn) 錄反 轉(zhuǎn) 錄P C R ( r e v e r s e transcription-PCR，RT-PCR) 是是一種簡(jiǎn)單、快捷地對(duì)一種簡(jiǎn)單、快捷地對(duì)RNA進(jìn)

9、行定性、進(jìn)行定性、定量分析的方法。它是以定量分析的方法。它是以mRNA為為模板，體外擴(kuò)增模板，體外擴(kuò)增cDNA，再以，再以cDNA為模板進(jìn)行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。RT-PCR技術(shù)一般用于技術(shù)一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽(yáng)性參照的定性分析；如果設(shè)置陽(yáng)性參照，則可對(duì)待測(cè)，則可對(duì)待測(cè)RNA樣品進(jìn)行半定量分樣品進(jìn)行半定量分析。析。該方法適合對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行初步該方法適合對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行初步篩選，目前已廣泛被實(shí)時(shí)定量篩選，目前已廣泛被實(shí)時(shí)定量PCR替代。替代。1反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCRTrans反轉(zhuǎn)錄酶系列 第13頁(yè)/共21頁(yè)第十四頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分

10、。 常用于常用于mRNA的定量分析的定量分析 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR) 是定量分是定量分析析mRNA的最通用、最快速、的最通用、最快速、最簡(jiǎn)便的方法，該方法是對(duì)最簡(jiǎn)便的方法，該方法是對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有很高的靈敏度和特異性。有很高的靈敏度和特異性。2實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRSYBR Green實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR分析原理示意圖分析原理示意圖 第14頁(yè)/共21頁(yè)第十五頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。*目前有目前有5種技術(shù)用于實(shí)時(shí)定量種技術(shù)用于實(shí)時(shí)定量

11、PCR 其中最經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的技術(shù)是利用其中最經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的技術(shù)是利用熒光染料熒光染料（如（如SYBR Green ）與雙鏈）與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加； 其他其他4種方法都是以熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸為探針與正種方法都是以熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸為探針與正確的擴(kuò)增子雜交，包括確的擴(kuò)增子雜交，包括5核酸酶法核酸酶法（即人們熟知的（即人們熟知的TaqManTM）、）、分子信標(biāo)分子信標(biāo)、ScropionsTM和和探針雜交法探針雜交法，它們擁有更強(qiáng)，它們擁有更強(qiáng)的特異性，可以避免對(duì)的特異性，可以避免對(duì)PCR后溶解曲線的需求，以及后后溶解曲線的需求

12、，以及后續(xù)的續(xù)的Southern雜交或?qū)U(kuò)增子的測(cè)序鑒定，但是雜交或?qū)U(kuò)增子的測(cè)序鑒定，但是成本較高成本較高。第15頁(yè)/共21頁(yè)第十六頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。芯片技術(shù)芯片技術(shù)nDNA芯片（芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡在固相支持物上有序固化寡核苷酸或核苷酸或DNA探針，與待探針，與待測(cè)熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交；測(cè)熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交；通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)、比較通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)、比較和分析，得出樣品的遺傳信息和分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達(dá)基因序列及表達(dá))； 亦被稱(chēng)作亦被稱(chēng)作DNA微陣列微陣列(DNA microarray)?；蛐酒ぷ髁鞒袒蛐酒ぷ髁?/p>

13、程第16頁(yè)/共21頁(yè)第十七頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。三、生物信息學(xué)是預(yù)測(cè)基因組結(jié)構(gòu)和功三、生物信息學(xué)是預(yù)測(cè)基因組結(jié)構(gòu)和功能的重要手段能的重要手段n數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)：數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)：匯集匯集了大量了大量DNA序列、蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)信息信息預(yù)測(cè)基因、基因產(chǎn)物的結(jié)預(yù)測(cè)基因、基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能；分析基因構(gòu)、功能；分析基因-基基因、基因因、基因-產(chǎn)物、產(chǎn)物產(chǎn)物、產(chǎn)物-產(chǎn)物之間的相互作用或聯(lián)產(chǎn)物之間的相互作用或聯(lián)系；描述細(xì)胞或整體水平系；描述細(xì)胞或整體水平的基因表達(dá)譜；推測(cè)系統(tǒng)的基因表達(dá)譜；推測(cè)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。發(fā)生關(guān)系。人類(lèi)X染色體圖譜第17頁(yè)/共21頁(yè)第十八頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十二分。NC

14、BI數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI首先創(chuàng)建首先創(chuàng)建GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 于于19911991年開(kāi)發(fā)了年開(kāi)發(fā)了Entrez數(shù)據(jù)庫(kù)檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了數(shù)據(jù)庫(kù)檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了GenBank、EMBL、PIR和和SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫(kù)的序列信息以及等數(shù)據(jù)庫(kù)的序列信息以及MEDLINEMEDLINE有關(guān)序列的文獻(xiàn)信息，并通過(guò)相關(guān)鏈接，將他們有機(jī)地有關(guān)序列的文獻(xiàn)信息，并通過(guò)相關(guān)鏈接，將他們有機(jī)地結(jié)合在一起結(jié)合在一起NCBI還提供了其他數(shù)據(jù)庫(kù)，包括在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳還提供了其他數(shù)據(jù)庫(kù)，包括在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳( (OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫(kù)（、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫(kù)（MMDB）、人類(lèi)基因序列集）、人類(lèi)基因序列集成（成（UniGene）、人類(lèi)基因組基因圖譜（）、人類(lèi)基因組基因圖譜（GMHG）、生物門(mén)類(lèi)）、生物門(mén)類(lèi)（Toxonomy） 等數(shù)據(jù)庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)第18頁(yè)/共21頁(yè)第十九頁(yè)，編輯于星期日：十八點(diǎn) 二十