芳基-3,二氫異喹啉類化合物的細(xì)胞毒性、構(gòu)效關(guān)系及其凋亡誘導(dǎo)機(jī)制的研究

1、2- 芳基-3,4- 二氫異喹啉類化合物的細(xì)胞毒性、構(gòu)效關(guān)系及其凋 亡誘導(dǎo)機(jī)制的研究含C=N<sup>+v/sup雙鍵的天然異喹啉類化合物是種類和含量相對(duì)較少且 結(jié)構(gòu)特殊的一類生物堿。該類化合物普遍具有顯著的抗癌、抗菌、殺蟲(chóng)、消炎或 抗氧化等重要的藥理活性 , 尤其在抗癌活性方面已引起了國(guó)內(nèi)外藥物研發(fā)人員的 高度興趣。但該類化合物存在著化學(xué)性質(zhì)活潑 , 分離和合成困難以及分子修飾位點(diǎn)少等 缺點(diǎn), 這在一定程度上制約了該類藥物的研究與應(yīng)用。新藥開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要途徑 是以天然活性物質(zhì)為先導(dǎo)或模板進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬。在我們課題組的前期研究中,曾以含C=N<sup>+</sup雙

2、鍵的兩個(gè)季銨類苯 并啡啶類化合物血根堿和白屈菜紅堿為模板 , 采用分子模擬原理 , 設(shè)計(jì)并合 成了一系列 2-芳基-3,4- 二氫異喹啉類化合物 , 發(fā)現(xiàn)后者具有和其模板化合物類 似的抗菌和殺螨活性 , 證明其可作為研發(fā)季銨類苯并啡啶類藥物的理想次級(jí)先導(dǎo) 化合物。本研究旨在進(jìn)一步考察 2-芳基-3,4- 二氫異喹啉類化合物的細(xì)胞毒活性 及其構(gòu)效關(guān)系 , 同時(shí)對(duì)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行初步研究 , 以期證明此類化合 物是否可作為其模板化合物的次級(jí)先導(dǎo)用于季銨類苯并啡啶類化合物抗癌藥物 的研究,同時(shí)為此類抗癌藥物的研發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。本研究取得的主要結(jié)果如下:1.采用MTT法,測(cè)定并評(píng)價(jià)了 3

3、個(gè)系列共103 個(gè)3,4-二氫異喹啉類化合物（溴化2-芳基-3,4-二氫異喹啉，1類；溴化2-芳基-8- 甲氧基-3,4-二氫異喹啉，11類;溴化2-芳基-8-羥基-3,4-二氫異喹啉,III類）、 1個(gè)系列共25個(gè)2-芳基-1氰基-1,2,3,4-四氫異喹啉（I '類）及1個(gè)II '類化 合物，即2- （2-碘苯基）-1氰基-8-甲氧基-1,2,3,4-四氫異喹啉（II ' -15）,對(duì)兩種癌細(xì)胞(NB4細(xì)胞和MKN-45細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明,在測(cè)定濃度< 20.0卩M時(shí),所有化合物對(duì)兩種細(xì)胞的增值都表現(xiàn)出一定的抑制活性,且每個(gè)化合物對(duì)NB4細(xì)胞的活性顯

4、著強(qiáng)于 MKN-45細(xì)胞。各類化合物的活性強(qiáng)弱次序?yàn)椋?類"I '類&gt;ll類&gt;III類。大部分I 類和I '類的活性強(qiáng)于白屈菜紅堿，但弱于血根堿；幾乎所有的II類和Ill類化 合物的活性都弱于血根堿和和白屈菜紅堿。其次,進(jìn)一步測(cè)定了 17個(gè)I '類和28個(gè)II類活性較強(qiáng)的化合物對(duì)兩種細(xì)胞 的毒力。結(jié)果顯示，I '類化合物對(duì)NB4細(xì)胞的IC₅₀為 0.16⁰.67 卩 g/mL (0.67²

5、.24 卩 M ,其活性均強(qiáng)于 6-氰 基二氫白屈菜紅堿(IC₅₀0.69卩g/mL,1.85卩M)和參考藥物 DDP(IC₅₀0 0.72 卩 g/mL,2.39 卩 M),但弱于 6-氰基二氫血根堿 (IC₅₀0 0.19 卩 g/mL,0.53 卩 M);l '類化合物對(duì) MKN-45細(xì)胞的 IC₅₀為 0.90³.50 卩 g/mL(2.99<s

6、up>1</sup>3.01 卩 M , 其活性均同樣強(qiáng)于6-氰基二氫白屈菜紅堿(IC₅₀0 4.74卩 g/mL,12.72 卩 M)和 DDP(IC₅₀0 3.41 卩 g/mL,11.36 卩 M),但弱于 6-氰 基二氫血根堿(IC₅₀0 0.55卩g/mL,1.53卩M);大部分II類化合物對(duì) NB4細(xì)胞的 IC₅₀為 0.68³.81 卩

7、 g/mL(1.54⁹.61 卩 ,其活性均弱于血根堿(IC₅₀0 0.51 卩 g/mL,0.53 卩 M)、白屈菜紅堿(IC₅₀0 0.71 卩 g/mL,1.49 卩 M)或 DDP(IC₅₀0 0.72 卩 g/mL,2.39 卩 M)。但是,大部分II類化合物對(duì)KMN-4理田細(xì)胞(IC₅₀&lt;3.4卩g/mL) 的活性強(qiáng)于白屈菜紅堿(IC<

8、sub>50</sub>0 6.04卩g/mL,12.71卩M)和DPP但低 細(xì)胞的活性(IC₅₀0 0.74卩g/mL,2.39卩M)與 6-氰基二氫白屈菜紅堿 和DDP相當(dāng)，但弱于6-氰基二氫血根堿；對(duì)MKN-45細(xì)胞的活性(IC₅₀0 0.77卩g/mL,2.50卩M)顯著強(qiáng)于6-氰基二氫白屈菜紅堿和 DDP但弱于6-氰基二氫血根堿。最后,測(cè)定了化合物I ' ₂和I ' ₁₇

9、;對(duì)兩株正常細(xì)胞 原代的羊胎兒成纖維細(xì)胞和原代的豬胎兒腎細(xì)胞的毒性。結(jié)果顯示，除了 I '₂對(duì)原代的豬胎兒腎細(xì)胞的毒性稍高其對(duì)MKN-45細(xì)胞外,1 '₂和I ' ₁₇對(duì)兩種正常細(xì)胞的毒性低于 DDP也低于其對(duì) 癌細(xì)胞的毒性 , 表明兩種化合物對(duì)癌細(xì)胞具有較高抑制選擇性。2. 對(duì)供試化合物的結(jié)構(gòu)與其細(xì)胞毒活性之間的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究。 結(jié)果表 明：(1) I類和相應(yīng)的I '類化合物對(duì)兩種癌細(xì)胞具有近似相同的毒性，表明后者 可能

10、是前者的前藥物。類似的情況也存在于血根堿和 6-氰基二氫血根堿或白屈菜紅堿和 6-氰基二 氫白屈菜紅堿上。(2)對(duì)于I類、I '類、II類和III類化合物來(lái)說(shuō)，對(duì)N-苯上 取代基的種類、數(shù)目和位置均可顯著影響化合物對(duì)兩種癌細(xì)胞的活性。(3) I類和I '類化合物具有完全相同的構(gòu)效關(guān)系：向N-苯環(huán)上引入吸電子 基, 如鹵素 , 三氟甲基和硝基等 , 可顯著增強(qiáng)其活性。 相反, 供電子基團(tuán)如甲基和甲 氧基等的引入則導(dǎo)致活性降低；對(duì)于弱吸電子的鹵素原子取代形成的I類或I ' 類異構(gòu)體而言,2 '-鹵代物的活性最高。類似的情況也存在于供電子取代基所形成的I類或I 

11、9;類異構(gòu)體上。此外， 二鹵代物較相應(yīng)的單鹵代物活性高 , 表明增加鹵原子取代數(shù)目可增強(qiáng)活性。對(duì)強(qiáng)吸電子的三氟甲基或硝基來(lái)說(shuō),3 '-取代物的活性最高，而2'-取代異 構(gòu)體的活性最小。(4)對(duì) II 類化合物來(lái)說(shuō) , 取代基種類對(duì)活性的影響與 I 類化合 物的情況相似但不完全相同 , 總的趨勢(shì)仍然是吸電子基增強(qiáng)活性 , 供電子基降低 活性。對(duì)NB4細(xì)胞而言，當(dāng)取代基為鹵素時(shí),4 '-鹵代的異構(gòu)體均給出最小的活性。 對(duì)于氟或氯而言,2 '-鹵代異構(gòu)體活性最高，而對(duì)于溴或碘時(shí),3 '-鹵代異構(gòu)體活 性最高；就KMN-45細(xì)胞而言,所有II類2'-鹵代

12、異構(gòu)體均顯示出最高的活性,但 3'-鹵代異構(gòu)體和4'-鹵代異構(gòu)體的活性則依取代基種類的不同而不同。對(duì) II 類化合物來(lái)說(shuō) , 氰基或三氟甲基的位置異構(gòu)對(duì)細(xì)胞的活性影響依細(xì)胞 種類的不同而具有不同的規(guī)律 , 表明強(qiáng)吸電子基的類型和位置均顯著影響 II 類 化合物對(duì)不同細(xì)胞的敏感性。與 I 類化合物的情況類似 , 二鹵代物的活性一般稍 高于其相應(yīng)的單鹵代物 , 表明增加鹵原子取代數(shù)目可增強(qiáng)活性。(5) 8-0H的引入可顯著降低所有I類化合物對(duì)兩種癌細(xì)胞的活性；8-OCH3 引入可增強(qiáng)部分化合物活性,尤其是對(duì)KMN-45細(xì)胞的活性。3.以l<sub>2</sub&g

13、t; 和 I₁₇ 為代表性化合物 , 研究了它們及其模板化合物血根堿和 白屈菜紅堿的抗氧活性。結(jié)果表明,四個(gè)化合物在較高濃度時(shí)均有一定的清除DPPHI由基和ABTS自由基的能力，同時(shí)也具有抗 Cu<sup>2+v/sup>/Hvsub>2v/sub>O<sub>2v/sub：體 系誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷的活性。四種物質(zhì)的抗氧化活性的強(qiáng)弱次序?yàn)椋貉鶋A &gt； 白屈菜紅堿 &gt；I₂&gt；I<sub>17</sub&

14、gt; 。但是, 四種物質(zhì)的抗氧化能力均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于參考物質(zhì) Trolox, 其抗氧化的IC₅₀值也遠(yuǎn)高于其對(duì)癌細(xì)胞的IC₅₀值，表明其對(duì)癌細(xì) 胞的增殖抑制可能與其抗氧化活性無(wú)關(guān)。4.通過(guò)細(xì)胞的DAPI染色、AO/EB染色、 超微結(jié)構(gòu)分析和蛋白酶活測(cè)定,研究表明，1 '類樣品對(duì)NB4細(xì)胞和MKN-45細(xì)胞具 有較為顯著的凋亡誘導(dǎo)作用 , 且具有濃度依賴性。其機(jī)制可能是通過(guò)引起ROS勺過(guò)量形成而到導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞分析表 明，供試化合物引起的凋亡細(xì)胞的多為早期凋亡細(xì)胞 ，且對(duì)細(xì)胞周期的阻滯無(wú)顯 著

15、影響。5.通過(guò)QRT-PC法測(cè)定12個(gè)凋亡相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn),代表樣品I '₂可以引起CFLAR,THBS1,CCN的mRN表達(dá)水平的上調(diào),且具有極顯 著性差異(p&lt;0.01 ) ;TNF,CYCS,CASPASECCNE2,GTSE的 mRN表達(dá)水平均 上調(diào)，且具有顯著性差異(p&lt;0.05 ) ;FAS,BAX和HDAC的 mRN表達(dá)水平的升 高，但無(wú)顯著性差異;BCL2的mRN表達(dá)水平下調(diào)，但無(wú)顯著性差異。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，樣品I ' ₂可通過(guò)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源途徑，如下 調(diào)Bcl-2/Bax 的蛋白表達(dá)，上調(diào)cyto-c 和上調(diào)cleaved