試驗(yàn)二培養(yǎng)基的配制和滅菌

1、實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配制和滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康奈⑸锏纳L發(fā)育都有一定的營養(yǎng)需要，培養(yǎng)基即人工培養(yǎng)微生物、為其生長發(fā)育提供所需營養(yǎng)的基質(zhì)。培養(yǎng)基配好后必須經(jīng)過滅菌方能用于分離培養(yǎng)微生物試驗(yàn)，因此培養(yǎng)基的配制和滅菌是植物病理實(shí)驗(yàn)室中最基本的工作，通過本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)植病實(shí)驗(yàn)室中常用培養(yǎng)基的配制方法和高壓滅菌鍋的使用方法。二、內(nèi)容、材料和方法（一）培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基按組成成分及對這些成分了解的程度分為天然培養(yǎng)基、半組合培養(yǎng)基和組合培養(yǎng)基三類，從物理性質(zhì)上又分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩類，培養(yǎng)基的種類不同， 配制方法也有差異，限于時(shí)間，本次實(shí)驗(yàn)僅配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。1馬鈴署蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（P

2、SA）這是植病實(shí)驗(yàn)室最常用的培養(yǎng)基（簡稱PSA）,主要用于植物病原真菌的分離和培養(yǎng)，有時(shí)也用于植物病原細(xì)菌。成分：馬鈴薯200克蔗糖1020克瓊脂1720克加水至1000毫升方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時(shí)，用雙層紗布濾去薯塊，補(bǔ)足水量，加 入瓊脂，加熱熔化，再加糖，待完全化后，乘熱用雙層紗布過濾分裝，塞好棉塞高壓滅菌。馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基略帶酸性，培養(yǎng)真菌無需調(diào)節(jié)pH,培養(yǎng)細(xì)菌則調(diào)節(jié) pH至中性，此培養(yǎng)基留作下次實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)病原真菌用，故不必調(diào)節(jié)pHo5人分作一組，1、2組各作此培養(yǎng)基500毫升，其中200毫升分裝試管，每管約 10毫升，滅菌后擺成斜面；其余300毫升，分裝在3個(gè)2

3、50 300毫升的三角瓶中，每瓶裝 100毫升左右，滅菌后妥善保存，留待下次實(shí)驗(yàn)使用。2 肉汁胨培養(yǎng)基（BPA這種培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的分離和培養(yǎng)成分：牛肉浸膏3克蛋白胨510克蔗糖10克酵母浸膏1克瓊脂1720克加水至1000毫升方法：先將瓊脂加熱熔化于大部水中，再將其它各成分用少量水化開加入，調(diào)節(jié)pH至7,趁熱用雙層紗布過濾，分裝，塞棉塞高壓滅菌。牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易稱重，稱重時(shí)用小燒杯盛裝，以玻璃棒沾取，故要先稱好杯和棒的重量后，再開始沾取浸膏稱重，稱后將杯和棒上粘著的浸膏洗凈于鍋中。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至中性的方法如下：配成 1N的HCI和NaOH并另分別稀釋配成 1/20 N 的

4、HCI和NaOH取培養(yǎng)基2毫升，加蒸餾水毫升，加指示劑溴百里酚藍(lán)指示劑5滴，這時(shí)如培養(yǎng)基的測樣呈黃色則用有刻度吸管加入1/20 N的NaOH若呈藍(lán)色則加入1/2O N的HCI，使培養(yǎng)基最后呈草綠色即調(diào)節(jié)到中性， 此刻所加酸或堿的毫升數(shù)的 25倍即等于在1000毫升 培養(yǎng)基中所需要加入IN的NaOH或HCI的毫升數(shù)（注意這次是作500毫升培養(yǎng)基），加蒸餾 水稀釋的目的防止調(diào)節(jié)過程中培養(yǎng)基凝固。調(diào)節(jié)pH至中性的簡便方法是用石蕊示紙。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培養(yǎng)基和溴百里酚藍(lán)或其它指示劑1 2滴，根據(jù)顏色反應(yīng)，在所配的培養(yǎng)液中加入少量IN的NaOH或 HCI，然后再取樣測定，如此反復(fù)多次，

5、達(dá)到所需求的反應(yīng)為止。5人分為一組，3、4兩組各作此培養(yǎng)基 500毫升，其中200毫升分裝試管，每管約 100 毫升，滅菌后擺成斜面，其余 300毫升分裝在3個(gè)250 300毫升的三角瓶中，每瓶裝 100 毫升左右，滅菌后妥善存放，留待下次實(shí)驗(yàn)使用。此外，1、2、3、4各組均制備15管試管裝和2瓶三角瓶裝的無菌水。(二)培養(yǎng)基的滅菌為了得到某種病原物的純培養(yǎng)，配好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌才能使用， 滅菌是指用物理 或化學(xué)方法完全殺死器物表面及其內(nèi)部的所有微生物，滅菌與消毒的概念不同，消毒則是指消滅器物或植物組織表面的某些微生物 (能常稱雜菌)，而不是消滅所有的微生物。滅菌的方法很多，植病實(shí)驗(yàn)室常用

6、的有干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌兩種方法，一般培養(yǎng)皿、吸管等玻璃儀器用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌。 而培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)用的土壤，則用高壓蒸汽滅菌法進(jìn) 行滅菌，具體滅菌方法和步驟如下：1干熱滅菌法(1) 將培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿洗凈干燥后，用舊報(bào)紙包好，或裝入特制的鐵筒中(每個(gè)吸管用紙包好后裝入鐵筒)，包紙時(shí)應(yīng)將吸取的一端放在取時(shí)先折開的一端，以便取用時(shí)手勿觸及要求滅菌的一端。(2) 將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。(3) 關(guān)緊箱門，打開排氣孔接上電源。(4) 待箱內(nèi)空氣排出到一定程度時(shí)，閉上排氣孔，繼續(xù)加熱至一定溫度后，用定溫固定 溫度，滅菌溫度一般 165C 175C保持1

7、小時(shí)即可。(5) 待自然降溫冷卻后(60 C以下)才能開門取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引 起玻璃器皿碎裂。2高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它的原理是利用高壓來提高蒸汽的溫度，達(dá)到滅菌的目的，其操作步驟如下：(1) 關(guān)好排水閥門放入清水至標(biāo)度為止，注意水量一定要加足，否則容易造成事故。(2) 將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關(guān)上器蓋，旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度(不要太緊)，然后再旋緊相對的兩個(gè)螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到徹底滅菌的目的。(3) 通電加溫，同時(shí)打開排氣活門，排盡鍋內(nèi)的空氣，即活門沖出的全部是蒸氣時(shí)

8、則表示徹底，此時(shí)可關(guān)閉排氣活門， 如果過早關(guān)閉活門，排氣不徹底，也達(dá)不到徹底滅菌的目的。通常當(dāng)壓力表指針升至 5磅時(shí)，打開排氣活門放氣，降至零點(diǎn)，再關(guān)閉活門。(4) 壓力表的指針上升時(shí)， 鍋內(nèi)溫度也逐漸升高， 當(dāng)壓力表指針升至15磅時(shí)，蒸氣溫度 相當(dāng)于120C 121C (等于一個(gè)大氣壓)，此時(shí)開始計(jì)算滅菌時(shí)間，控制熱源，使處于 15磅 壓力保持30分鐘，即能達(dá)到完全滅菌的目的，然后停止加溫。(5) 稍微打開一點(diǎn)排氣活門，使鍋內(nèi)蒸氣緩慢排除，然后逐漸開大活門， 氣壓徐徐下降，注意勿使排氣過快，否則會使鍋內(nèi)的培養(yǎng)基沸騰而沖脫或沾濕棉花塞，但排氣太慢又使培養(yǎng)基在鍋內(nèi)，受高溫處理時(shí)間過長，這樣對培養(yǎng)

9、基也是不利的。一般從排氣到打開鍋蓋以10分鐘左右為好。(6) 當(dāng)壓力表指針降到零、鍋內(nèi)蒸氣完全排盡時(shí)，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基，如需制備固體 斜面培養(yǎng)基時(shí)，則應(yīng)趁熱將試管斜放在桌上，上面蓋上報(bào)紙以免落灰塵，冷卻后便可收起。(7) 最后將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。(8) 抽取上述火菌的培養(yǎng)基，放入25C溫箱中，48小時(shí)后不見雜菌生出，便證明培養(yǎng)基已達(dá)到滅菌目的，可以使用。此外，有些培養(yǎng)基在經(jīng)高壓滅菌后， 其營養(yǎng)成分容易分解而失去使用價(jià)值， 此時(shí)可采用 間歇蒸氣滅菌法，即將培養(yǎng)基放入高壓滅菌器內(nèi)，加熱至100C,保持1小時(shí)，每天滅菌一次，連續(xù)進(jìn)行三次，即可達(dá)到滅菌的目的，又不至使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)分解。三、思考題

10、1培養(yǎng)基有哪幾種類別 各有什么特點(diǎn)和用途？2干熱滅菌和高壓蒸汽法適用范圍如何電熱烘箱和高壓鍋如何操作各有哪些使用注意事項(xiàng)？3怎樣檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底？關(guān)于微生物實(shí)驗(yàn)-培養(yǎng)基的配制和滅菌的思考題！急！2010-5-8 19:32提問者： 喜歡和愛123|瀏覽次數(shù)：1520次1. 在一般情況下為什么試管或三角瓶培養(yǎng)基要用棉花塞而不用軟木塞或橡皮塞2. 高壓蒸汽滅菌過程中為什么一定要排放鍋內(nèi)的冷空氣我來幫他解答2010-5-8 19:58滿意回答1. 棉花起到過濾、透氣的作用??！并且棉花的開頭大小是可以盡可能改變的，而不需要非得找到合適的軟木或橡皮塞！2. 高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉

11、的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸氣不能溢出， 而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100C的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度 低于飽和蒸汽的溫度。滅菌更徹底！常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒2006-09-20 00:00:00 來源： 評論：0 我要評論一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一

12、般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馀囵B(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛

13、和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供微生物生長繁殖之用。干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。三、試劑與器材1. 器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽 滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、 微孔濾膜過濾器、鑷子等。試劑牛肉膏、蛋白胨、NaCI、瓊脂四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 稱量t溶化t調(diào) pH過濾t分裝t加塞t包扎t火菌t無菌檢查2. 干熱滅菌：裝入待滅菌物品T升溫T恒溫T降溫T開箱取物3. 高

14、壓蒸汽滅菌：加水t裝物品t加蓋t加熱t(yī)排冷空氣t加壓t恒壓t降壓回零t排汽t取物T無菌檢查4. 過濾除菌：組裝滅菌T連接T壓濾T無菌檢查T清洗滅菌五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)1. 要嚴(yán)格按配方配制。2. 調(diào)pH不要過頭。3. 干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時(shí)間控制，70o C以下放物、取物。4. 高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時(shí)降壓回零取物。5. 過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時(shí)，壓力要適當(dāng)，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。培養(yǎng)基的制備與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：(1) 熟悉玻璃器皿的洗滌包裝和滅菌前的準(zhǔn)備工作。(2) 學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)基和無菌水的制備，了解培養(yǎng)基配方中各

15、成分的作用、制備流程及各 環(huán)節(jié)的操作技術(shù)與應(yīng)用。(3) 學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關(guān)鍵技術(shù)和滅菌技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基的制備原理培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組分的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。人工制 備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的器皿 中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場所。自然界中，微生物種類繁多，由于微生物具有 不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究上的目的不同，所以培養(yǎng) 基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類和不同組成的培養(yǎng)基中，均應(yīng)含有滿足微生物 生長發(fā)育的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長素以及

16、某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基 還應(yīng)具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。根據(jù)制備培養(yǎng)基對所選用的營養(yǎng)物質(zhì)的來源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和 合成培養(yǎng)基三類。按照培養(yǎng)基的形態(tài)可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基 使用目的，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基的類型和種類是多種多樣的，必須根據(jù)不同的微生物和不同的目的進(jìn)行選擇配制，本 實(shí)驗(yàn)分別配制常用培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、

17、明膠和硅酸鈉，其 中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用凝 固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95C的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到 45C才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)（25 C-37C）不會融化而保持固體狀態(tài)。高壓蒸氣滅菌原理高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100C的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌

18、的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低（表V -2），二是濕熱的穿透力比干熱大（表V -3）;三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100C時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。表V -2蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系卵自蛋白含水量（）30分鐘內(nèi)凝固所需溫度（C）50562574-801880-9061450160-170表V -3干熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較溫度（C）時(shí)間（小時(shí)）透過布層的溫度（C）滅菌20層40層100層干熱 13

19、0-14048672不完全濕熱3101101101完全在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝馀蛎泬?大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低 于飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系見表V-4。一般培養(yǎng)基用15-30分鐘可達(dá)到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì) 和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用cm2（8磅/英寸2） ,C滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行C,20分鐘滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以滅菌20分鐘即可，而盛于

20、大瓶內(nèi)的培養(yǎng)基最好以cmf滅菌30分鐘。表V -4滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系壓力數(shù)全部空氣排出2/3空氣排出1/2空氣排出1/3空氣排出時(shí)的溫度（C）空氣全不排出時(shí)的溫度（C）千克磅/英（公斤/寸2時(shí)的溫時(shí)的溫時(shí)的溫厘米2）(1b/i n度度（C）度(kg/cm2)(C)(C)2)5100949072101091051009015115112109100201211181151092512612412111530130128126121蒸汽壓力所用單位為kg/cm2（千克/厘米2），它與1b/in 2（磅/英寸2）和溫度的換算關(guān)系見表V -5。表V -5蒸汽壓力與蒸汽溫度換算關(guān)系蒸汽壓力大氣壓壓力表讀數(shù)蒸汽溫度kg/cm21b/in 2三、實(shí)驗(yàn)器材1、藥品瓊脂，10% HCL,10% NaOH牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方藥品；2、 材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，電子稱，10X 200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃 棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，試管盒，紗布，棉花，報(bào)紙，麻繩，標(biāo)簽，培養(yǎng)皿。3、設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 稱取藥品放在大燒杯中，加入蒸餾水用玻璃棒攪拌并加熱溶化，等藥品溶解后用pH試紙調(diào)節(jié)p H至，如有沉淀應(yīng)過濾后分裝，每支試管約加入9ml。每組分裝30支，加上棉塞，包上牛皮紙，準(zhǔn)備滅菌。裝入試