調(diào)節(jié)SREBP-2細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)自噬流對脂質(zhì)代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

1、調(diào)節(jié)SREBP-2細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)自噬流對脂質(zhì)代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響目的：探討通過抑制S1P或/和S2P蛋白生物活性或沉默兩者基因 表達(dá)，是否影響細(xì)胞內(nèi)SREBP-2專運(yùn)過程、自噬相關(guān)基因的表達(dá)以及 細(xì)胞自噬流動態(tài)過程。方法:1.用不同濃度S1P特異性抑制劑 PF-429242（1、10、30 卩 M）或 S2P特異性抑制劑 Nelfinavir（NFV）（5 、 10、20卩M）干預(yù)人肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，干預(yù)不同時間 （0、4、8、24 h）,采用qRT-PCF和Western blot 方法檢測自噬相關(guān) 基因和S1R S2R SREBP-2基因表達(dá)水平；用LC3-GFP

2、-mRF雙標(biāo)質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h后，加入PF-429242（30卩M）或 NFV（20卩M）或/和自噬溶酶體抑制劑氯喹（chloroquine,CQ）（50 卩M） 干預(yù)24h,采用Western blot方法檢測LC3蛋白表達(dá)，并且在激光共 聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬流的變化情況。2.用S1P shRNA及 S2PshRNA轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞 AML-12細(xì)胞，采用qRT-PCF和 Western blot 方法檢測自噬相關(guān)基因和 SIR S2R SREBP-2基因表達(dá)水平。結(jié) 果:1.S1P特異性抑制劑PF-429242或S2P特異性抑制劑NFV促進(jìn)細(xì) 胞自噬基因

3、的表達(dá) ,呈時間和劑量依賴關(guān)系。 與對照組相比 ,S1P S2P 及SREBP-2mRN表達(dá)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨著干預(yù)濃度增加、時間 延長,SREBP-2前體形式P-SREBP-2蛋白表達(dá)增加，活化片段 N-SREBP-2蛋白表達(dá)降低。Western blot 檢測顯示 PF-429242 和 CQ 共同干預(yù)組或NFV和CQ共同干預(yù)組丄C3-II/LC3-I 蛋白比例顯著增 加, 激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) , 與對照組相比 ,PF-429242 或者 NFV 單獨(dú)干預(yù)組細(xì)胞中的紅色斑點(diǎn)顯著增加，而與PF-429242或者NFV單 獨(dú)干預(yù)組相比，與CQ共同干預(yù)組黃色斑點(diǎn)明顯增加，提示PF-42

4、9242 或NFV都能增強(qiáng)細(xì)胞自噬流。2.抑制S1P S2P基因表達(dá)后，白噬相關(guān) 基因ATG5 ATG7和Beclin 1 表達(dá)水平明顯升高，但是SREBP-2 mRNA 水平無明顯變化，P-SREBP-2及LC3-H /LC3- I蛋白表達(dá)增 加,N-SREBP-2蛋白表達(dá)減低。結(jié)論：抑制S1P或S2P蛋白功能活性影 響SREBP-2蛋白表達(dá)水平可以促進(jìn)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自 噬流。抑制S1P或 S2P基因的表達(dá)也可以影響SREBP-2蛋白表達(dá)水平， 促進(jìn)自噬相關(guān)基因的表達(dá)。目的：探討NAFLD患者肝臟組織標(biāo)本、棕 櫚酸誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞和高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟組織中SREBP-2

5、蛋白表達(dá)水平和自噬活性水平變化情況，以及在細(xì)胞和小鼠 脂肪變模型中調(diào)節(jié)SREBP-2的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)對脂質(zhì)自噬的影響及意義。方法:1.19例NAFLD患者肝臟組織和16例正常肝臟組織用于 Western blot檢測SREBP-2蛋白前體形式(P-SREBP-2)、入核活化片段N端 (N-SREBP-2)和 SCAPt白表達(dá)水平，以及自噬相關(guān)蛋白LC3B和溶酶體 相關(guān)膜蛋白LAMP1的表達(dá)水平；肝組織石蠟包埋切片用于免疫熒光雙 標(biāo)染色,觀察LC3和LAMP1共定位情況。2.用棕櫚酸(palmitic acid,PA)干預(yù)HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，構(gòu)建脂肪變細(xì)胞模型，再用 S1P特異性抑制

6、劑PF-429242或/和S2P特異性抑制劑NFV十預(yù)細(xì)胞， 采用 Western blot 方法檢測 P-SREBP-2、N-SREBP-2 SCAP 自噬 相關(guān)蛋白LC3、ATG5 Beclin1、LAMP1及自噬體底物蛋白死骨片蛋 白(sequestosome 1,SQSTM1)的蛋白表達(dá)情況；脂肪變性肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染LC3-GFP-mRF雙標(biāo)質(zhì)粒，再用PF-429242或/和NFV或CQ干預(yù)，在共 聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)紅、綠、黃色斑點(diǎn) ; 利用透射電子顯微鏡觀察 處理后的細(xì)胞內(nèi)脂滴、自噬體、自噬溶酶體情況，用油紅0染色觀察 細(xì)胞內(nèi)脂滴，用100%異丙醇溶解這些結(jié)合在細(xì)胞脂滴上的油紅O,用51

7、0nM吸光度定量，同時,用酶法定量細(xì)胞裂解液中的甘油三脂 (triglyceride,TG) 和膽固醇 (total cholesterol,TC) 含量。 3.在高 脂飼料(high-fat diet,HFD) 喂養(yǎng)19周的C57BL/6小鼠中，通過小鼠 尾靜脈注射S1P S2PshRN包裝的慢病毒,14天后處死各組小鼠。用 qRT-PC肪法檢測S1P和 S2PmRNA表達(dá)水平,用 Western blot 方法 檢測 P-SREBP-2、N-SREBP-2、SCAP、LAMP1 SQSTM1ATG5、Beclin1 和LC3B蛋白表達(dá)水平，用免疫熒光雙標(biāo)染色共聚焦法檢測 SREBP-和 S

8、CAPB胞內(nèi)定位以及LC3和LAMP定位及表達(dá)；利用透射電子顯微鏡 觀察各組小鼠肝臟細(xì)胞中脂滴、自噬體、自噬溶酶體情況 ,用油紅 0 染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴 ,同時,用酶法定量各組小鼠血清中的 TG、TC、 谷草轉(zhuǎn)氨酶 (glutamic oxaloacetic transaminase,G0T) 和谷丙轉(zhuǎn)氨 酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)的含量。結(jié)果:1.與對照組 相比,NAFLD組肝臟組織中N-SREBP-2的表達(dá)增加，且SCAP表達(dá)增 多丄C3- II /LC3- I表達(dá)增加，同時LAMP1表達(dá)降低；免疫熒光雙標(biāo)染 色顯示LC3綠色斑點(diǎn)數(shù)顯著增加 丄

9、AMP1紅色斑點(diǎn)數(shù)輕微降低。2.在 PA干預(yù)的HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中，N-SREBP-2 SCAP表達(dá)增力口 , 而P-SREBP-2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 丄C3- I /LC3- I表達(dá)增加，ATG5 Beclin1也輕微增加，SQSTM表達(dá)也增加，LAMP1表達(dá)降低。在PA干 預(yù)的基礎(chǔ)上，用NFV和/或PF-429242干預(yù)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)N-SREBP-2SCAP 表達(dá)降低，而 P-SREBP-2增力口 丄C3- II /LC3- I、ATG5 Beclin 1 及 LAMP俵達(dá)都增加，同時SQSTM表達(dá)降低；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā) 現(xiàn)HL-7702細(xì)胞和HepG2細(xì)胞在PA干預(yù)

10、后,與CC干預(yù)后一致，僅有綠 色和黃色斑點(diǎn)增加，而加用NFV和/或PF-429242干預(yù)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中 黃色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)都增加 , 尤其是不能重合的紅色斑點(diǎn)顯著增加 ； 透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在 PA干預(yù)后,在大量脂滴沉積時，自噬體囊 泡也形成，而加用NFV和/或PF-429242干預(yù)后，雙層膜的自噬體及單 層膜的自噬溶酶體都大量積累 , 且可以觀察到正在吞噬脂滴的自噬體 , 細(xì)胞內(nèi)脂滴減少；油紅0染色結(jié)果顯示大量脂滴沉積在PA干預(yù)的細(xì)胞 中,油紅定量檢測也顯示PA干預(yù)組脂滴積累明顯增高，TG、TC含量也 明顯升高，而加NFV和/或PF-429242干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積明顯減 少,TG、TC

11、含量明顯降低。3.qRT-PCR結(jié)果顯示沉默組S1P和 S2PmRNA 水平分別降低了 56%和52% Western blot結(jié)果顯示HFD陰性對照(negative control,NC)組 N-SREBP-2表達(dá)增加,而沉默組 N-SREBP-2表達(dá)降低,P-SREBP-2積累；共聚焦顯微鏡下也可觀察到在 NC組,細(xì)胞 核內(nèi)大量SREBP-2溶解蛋白積累，而沉默組細(xì)胞核內(nèi)SREBP-2表達(dá)減 少； 相對于正常飼料 (regular chow diet,CHD) 喂養(yǎng)組, 沉默組 LC3-I /LC3- I、ATG5 Beclin 1 蛋白表達(dá)增加，相對于NC組,SQSTM蛋白 表達(dá)降低,

12、LAMP1蛋白表達(dá)增加；免疫熒光共聚焦也顯示 NC組表現(xiàn)為 LC3綠色熒光斑點(diǎn)增加，而沉默組LAMP紅色熒光斑點(diǎn)明顯增加；電鏡 也表明相對于CHDS,NC組自噬體數(shù)量增加，沉默組自噬體和自噬溶 酶體數(shù)量增多，且細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少、脂滴體積減??；油紅0染色顯 示NC組肝細(xì)胞大量脂滴沉積，沉默組脂滴沉積顯著減少。相對于 NC 組,沉默組血清TG GOT及 GPT含量顯著降低,TC含量輕微降低。結(jié) 論:1.在NAFLD患者肝臟組織、棕櫚酸誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞和高脂 飼料喂養(yǎng)的小鼠肝臟組織中，都存在SREBP-2異?；罨白允闪魇軗p 的情況。2.在PA處理的脂肪變細(xì)胞模型中，用NFV和/或PF-429

13、242 干預(yù)細(xì)胞抑制SREBP-2舌化裂解，可以增強(qiáng)肝細(xì)胞自噬流，促進(jìn)脂質(zhì) 自噬，降解脂質(zhì)，減少脂質(zhì)含量。3.在HFDJ、鼠模型中,S1P和S2PshRNA 沉默小鼠肝臟中S1P和S2P基因表達(dá)，同樣可以抑制SREBP-2舌化裂 解,增強(qiáng)肝細(xì)胞自噬流 ,促進(jìn)脂質(zhì)自噬 ,降解脂質(zhì),減少脂質(zhì)含量。 目的: 探討在體內(nèi)外脂肪變模型中調(diào)節(jié) SREBP-2細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)恢復(fù)細(xì)胞自噬 流對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響及意義。方法：1.用S1P特異性抑制劑 PF-429242或/和S2P特異性抑制劑NFV或自噬溶酶體抑制劑CQ干預(yù) 游離脂肪酸棕櫚酸PA誘導(dǎo)的脂肪變HL-7702細(xì)胞和HepGZ田胞，采用 Western b

14、lot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子標(biāo)記物 PERK P-PERK EIF2 a 及P-EIF2 a蛋白表達(dá)情況，并用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，在熒光顯微鏡 下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)改變 ,并對每組凋亡的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。 2.在高 脂飼料喂養(yǎng)19周的C57BL/6小鼠中，通過小鼠尾靜脈注射S1P和 S2PshRNAS裝的慢病毒,14天后處死各組小鼠。用 Western blot方 法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子標(biāo)記物 PERK、 P-PERK、 EIF2a 及 P-EIF2a 蛋 白表達(dá)情況。結(jié)果:1.在體外脂肪變性細(xì)胞模型中，用NFV和/或 PF-429242干預(yù)后,P-PERK,P-EIF2 a蛋白表達(dá)顯著降低。而在 NFV和/或PF-429242干預(yù)的基礎(chǔ)上，加CQ干預(yù)后，P-PERK和P-EIF