《生化產(chǎn)品檢測(cè)與》的實(shí)驗(yàn)

1、生化產(chǎn)品檢測(cè)與分析的實(shí)驗(yàn)教案1直接滴定法測(cè)定豆奶粉中總糖的含量2苔黑酚法測(cè)定RNA的含量3氣相色譜法測(cè)定食用酒中乙醇含量（內(nèi)標(biāo)法）或液相色譜法測(cè)VC含量4生物傳感器的制作及其葡萄糖濃度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)一 直接滴定法測(cè)定豆奶粉中總糖的含量還原糖包括葡萄糖、果糖、麥芽糖。在測(cè)定還原糖時(shí)一般測(cè)定總糖時(shí)所有將糖類水解為轉(zhuǎn)化糖再測(cè)定的方法都可用來(lái)測(cè)定還原糖。一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握費(fèi)氏試劑法測(cè)定還原糖含量的方法2 學(xué)習(xí)糖類測(cè)定時(shí)澄清劑的選擇方法二實(shí)驗(yàn)原理：淀粉等多糖在強(qiáng)酸下進(jìn)行水解獲得還原性糖。將一定量的堿性酒石酸銅甲、乙液等量混合，立即生成天藍(lán)色的氫氧化銅沉淀；沉淀很快與酒石酸鉀反應(yīng)，生成深藍(lán)色的可溶性酒石酸鉀

2、鈉銅絡(luò)合物。在加熱條件下，以次甲基藍(lán)作為指示劑，用樣液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應(yīng)，生成紅色的氧化亞銅沉淀；這種沉淀與亞鐵氰化鉀絡(luò)合成可溶的無(wú)色絡(luò)合物；二價(jià)銅全部被還原后，稍過(guò)量的還原糖把次甲基藍(lán)還原，溶液由蘭色變?yōu)闊o(wú)色，即為滴定終點(diǎn)；根據(jù)樣液消耗量可計(jì)算出還原糖含量。三設(shè)備與耗材水浴鍋，容量瓶，三角燒瓶（250 ml），柄皿（100 ml），可調(diào)電爐，滴定管，移液管，漏斗四試劑（1）    斐林氏A液：稱15g五水硫酸銅和0.05g亞甲基藍(lán)溶于水中轉(zhuǎn)入1000ml容量瓶中并定容。（2）    斐林氏B液：稱50g酒石酸鉀鈉

3、及75gNaOH溶入水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至1000 ml貯存于橡膠塞玻璃瓶?jī)?nèi)。（3）0.1%甲基紅指示劑：稱取0.1g甲基紅加60%的乙醇溶解并稀釋至100ml放在滴瓶里待用。（4）乙酸鋅溶液：稱取21.9g乙酸鋅加3 ml冰乙酸加水溶解并定容至100ml（5）10.6%亞鐵氰化鉀溶液（6）6M HCl：量取50ml HCl加水稀釋至100 ml（7）20% NaOH溶液（8）1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取1.000g經(jīng)過(guò)98-100干燥至恒重的葡萄糖，加水溶解后加入5 ml鹽酸并用水稀釋定容至1000 ml。五操作步驟1樣品處理：稱取2.5g樣品于50mL燒

4、杯用100mL80的水分次溶解并倒入250mL容量瓶中，搖勻后慢慢加入5mL乙酸鋅液和5mL亞鐵氰化鉀，搖勻后定容，靜置半小時(shí)用干燥濾紙過(guò)濾，去初濾液，液備用。2糖水解后得樣液：吸取50mL濾液于250mL容量瓶中加5mL6M HCl在68-70水浴中保溫15min，冷卻后加1滴甲基紅指示劑用20% NaOH溶液中和至中性，加水定容作為待測(cè)液。3標(biāo)定費(fèi)氏試劑：吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，控制2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以先快后慢的速度滴加至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄下來(lái)，平行三份。計(jì)算出費(fèi)氏試劑相當(dāng)?shù)钠咸烟呛浚╩g）。4樣品溶液預(yù)測(cè)吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，控制2mi

5、n內(nèi)加熱至沸趁沸以先快后慢的速度滴加樣液至藍(lán)色變淺以每秒一滴的速度滴定至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積。5正式滴定：吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，加比預(yù)定量少1.0ml樣液2分鐘內(nèi)要求沸騰趁沸以每秒一滴的速度滴定至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積。平行三次。6計(jì)算：F：與10ml斐林氏試液相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化糖毫克數(shù)，V1：樣品試液總體積V2：樣品試液滴定量W：樣品重量7思考題（1）本法采用的澄清劑是什么，為什么不采用銅鹽作為澄清劑？（2）堿性酒石酸銅甲液和乙液為什么要分別貯存，用時(shí)才混合？（3）滴定時(shí)為什么必須在沸騰條件下進(jìn)行？（4）樣品溶液預(yù)測(cè)的目的是什么？實(shí)驗(yàn)二 苔黑酚法測(cè)定

6、RNA的含量一、原理 當(dāng)RNA與苔黑酚(3，5-二羥基甲苯) 在沸水中加熱時(shí)，RNA被酸降解，所產(chǎn)生的核糖進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡c苔黑酚在高鐵離子的催化下可反應(yīng)生成綠色復(fù)合物，后者在670nm處有最大吸收峰，在10100mg/mL范圍內(nèi)其吸光度值與RNA濃度有線形關(guān)系。二、試劑和器材 1. 試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)RNA母液準(zhǔn)確稱取RNA10.0mg，用少量水溶解（如不溶可滴加濃氨水，調(diào)pH7.0），定容至10mL，此溶液為1mg/mL。（2）0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液（配制10mL）；（3）苔黑酚-三氯化鐵試劑（臨用時(shí)配配制）：將100mg苔黑酚溶于100mL濃鹽酸中，再加入100mgFeCl3&#

7、183;6H2O。（4）10%硫酸溶液（5）5%硝酸銀溶液（配制50mL）(6)0.2%氫氧化鈉溶液（配制50mL）此外還有干酵母粉，無(wú)水乙醇，氨水，無(wú)水乙醚(500mL，分析純）2瓶，乙酸，氫氧化鈉。三氯乙酸，CuCl2·H2O。2. 器材 可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋三、操作步驟1RNA的提取稱取8g干酵母粉于100燒杯中，加入0.2%氫氧化鈉溶液40 mL，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。冷卻加入乙酸數(shù)滴使pH為5-6(用石蕊試紙?jiān)?，離心10-15分鐘（4000轉(zhuǎn)/分鐘）取上清液，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過(guò)濾，濾渣用乙醇洗2次，每次體積約10 mL，繼而用乙醚洗2

8、次，每次體積約10 mL。乙醚濾干后，濾渣作為粗RNA，作鑒定和測(cè)定含量用。2. 鑒定 取上述RNA約0.5g，加10%硫酸溶液5mL，加熱至沸1-2分鐘，將RNA水解。(1)吸水解液0.5 mL，加苔黑酚-三氯化鐵試劑1mL，加熱至沸1分鐘觀察顏色變化；（2）吸水解液2 mL，加氨水2 mL及5%硝酸銀溶液1 mL，觀察是否產(chǎn)生絮狀的嘌呤銀化合物。（有時(shí)絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置十幾分鐘）。3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取12只試管分成6組，按下表操作。取2管的平均值，以DNA濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4 樣品的測(cè)定將一定量的RNA粗品用水溶解并定容，RNA濃度在10100mg/mL范

9、圍內(nèi)，取1.0mL樣液于6號(hào)試管中，加水1.0mL及苔黑酚-三氯化鐵試劑2.0mL，沸水浴保溫45分鐘，冷卻測(cè)A。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋關(guān)系測(cè)的RNA的質(zhì)量。四.注意事項(xiàng) 樣品蛋白質(zhì)含量高時(shí)，應(yīng)先用5三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)；有較多DNA樣品時(shí)也會(huì)發(fā)生干擾，可在試劑中加適量的CuCl2·H2O， 可減少DNA的干擾。五思考題鑒定中加入硝酸銀的目的是什么?實(shí)驗(yàn)三氣相色譜法測(cè)定食用酒中乙醇含量（內(nèi)標(biāo)法）一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解氣相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)；2.學(xué)習(xí)和掌握使用氫火焰離子化檢測(cè)器的基本操作；3.掌握以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行色譜定量分析的方法及特點(diǎn)；4.學(xué)習(xí)氣相色譜法測(cè)定乙醇含量的分析方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 氣相色譜

10、法是一種高效、快速而靈敏的分離分析技術(shù)。 當(dāng)液體樣品由進(jìn)樣口注入后立即被汽化，并被載氣帶入色譜柱，經(jīng)過(guò)多次分配而得以分離的各個(gè)組分逐一流出色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，隨時(shí)間變化而產(chǎn)生的電信號(hào)由記錄儀得到氣相色譜圖。對(duì)氣相色譜圖進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，即可對(duì)樣品進(jìn)行定性定量分析。三、儀器與試劑 1.儀器：氣相色譜儀、氫火焰檢測(cè)器（FID）、色譜柱、微量注射器、容量瓶（10cm3）、色譜工作站、吸量管（2、5cm3）。 2.試劑：無(wú)水乙醇(A.R)、無(wú)水n-C3H7OH(A.R)、丙酮、食用酒。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 色譜操作條件 柱溫：90；汽化室溫度：150；檢測(cè)器溫度：130；N2（載氣）流速：0.5cm3/min；

11、H2：5542 KPa；空氣：42 KPa； 2.標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定 用吸量管準(zhǔn)確吸取0.50cm3無(wú)水乙醇和0.50cm3無(wú)水n-C3H7OH于10cm3的容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.5L標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入色譜儀內(nèi)，記錄各色譜峰的保留時(shí)間tR和色譜峰面積，求出以無(wú)水n-C3H7OH為標(biāo)準(zhǔn)物的相對(duì)校正因子。3.樣品溶液的測(cè)定 用吸管吸取1.00cm3的食用酒樣品和0.50cm3的內(nèi)標(biāo)物（無(wú)水n-C3H7OH）于10cm3容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.5L樣品溶液，注入色譜儀內(nèi)，記錄各色譜峰的保留時(shí)間tR，對(duì)照比較標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液的tR，以確定樣品中的

12、醇，記錄 C2H5OH和n-C3H7OH色譜峰面積，求出樣品中C2H5OH的含量。 實(shí)驗(yàn)四 生物傳感器的制作及其葡萄糖濃度的測(cè)定（探索性實(shí)驗(yàn)）參考賈仕儒編的生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)244-248一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馍飩鞲衅鞯囊话愎ぷ髟?，掌握制作酶?jìng)鞲衅骱褪褂闷錅y(cè)定葡萄糖濃度的方法。二 實(shí)驗(yàn)原理這時(shí)溶液中氧濃度的下降，相應(yīng)的氧電極上的還原電流減少，通過(guò)電流值的變化可以確定葡萄糖的濃度。三 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料（1） 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及儀器電化學(xué)工作站、磁力攪拌器、pH計(jì)和超聲波清洗器（2） 實(shí)驗(yàn)材料葡萄糖氧化酶(Sigma公司，2000u/g)，濃硫酸，丙酮，無(wú)水乙醇，葡萄糖（3），硝酸纖維素膜(規(guī)格: 1

13、5X20cm 孔徑: 0.45m  )，磷酸二氫鉀（0.1M），磷酸氫二納（0.1M）。四 實(shí)驗(yàn)步驟三電極體系：酶膜修飾玻碳電極作工作電極，飽和甘汞電極( J6L) 為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。（1） 工作電極的制作：玻碳電極（GC）依次用1.0 um a-氧化鋁粉； 0.3 um a-氧化鋁粉； 0.05 um g-氧化鋁粉及麂皮拋光至呈鏡面，再依次在水、無(wú)水乙醇和水中進(jìn)行超聲清洗，于紅外燈下烘干備用。在0.5mL，0.1M磷酸緩沖液(pH 7，由磷酸二氫鉀（0.1M）和磷酸氫二納（0.1M）以1:2的體積比混合制成)中加入1mg葡萄糖氧化酶。溶解后加入一圓形，大小與玻碳電極的頂部尺寸相同為宜的硝酸纖維素膜進(jìn)行酶的吸附半小時(shí)。用