發(fā)酵工藝實驗

1、實驗一 菌種的傳代培養(yǎng) 一、實驗?zāi)康? 掌握菌種傳代培養(yǎng)的原理2 掌握菌種傳代培養(yǎng)的操作過程二、實驗原理細胞在培養(yǎng)器中長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長并且活化細胞的代謝性能，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）?；罨蟮木N經(jīng)過擴大培養(yǎng)就會大量繁殖，把菌種通過逐級擴大培養(yǎng)，使其大量繁殖并保留生長更加良好的菌種。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法，同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。三、實驗器材1菌種：金色鏈霉菌2培養(yǎng)基（麩皮培養(yǎng)基）：麩皮 360克； 磷酸氫二胺 30克； 磷酸氫二鉀 02克； 硫酸鎂 01克； 瓊脂 150克； 蒸餾水 10升； ph 7

2、03其它：電子天平；250ml三角瓶；電爐；滅菌鍋；培養(yǎng)皿（5個）；試管；無菌操作臺；酒精燈；接種環(huán)；涂布棒；報紙；細繩；棉塞；牛皮紙；玻璃棒。四、實驗步驟使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)菌種1. 按上述培養(yǎng)基配方配制250毫升培養(yǎng)基，裝入一只三角瓶中，加熱使藥品溶解，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮紙扎緊，以備滅菌。2. 把培養(yǎng)皿用報紙包好，細繩系牢，以備滅菌。3. 把物品放入滅菌鍋中在121下滅菌1520分鐘，滅菌后放入已殺菌的無菌操作臺中。4. 在無菌條件下，在每只培養(yǎng)皿中分別倒入培養(yǎng)基20ml左右，放平，冷卻后備用。5. 待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在無菌條件下，選擇一個生長良好的菌種，用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上接種，并用

3、涂布棒將菌種均勻涂遍整個培養(yǎng)皿。6. 將接種好的平板做好標(biāo)號后，將其放入29的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置培養(yǎng)。使用試管培養(yǎng)菌種1按上述培養(yǎng)基配方配制250毫升培養(yǎng)基，裝入一只三角瓶中，加熱使藥品溶解，然后將其倒入試管用棉塞塞住瓶口，并用牛皮紙扎緊，以備滅菌。2 把物品放入滅菌鍋中在121下滅菌1520分鐘，滅菌后放入已殺菌的無菌操作臺中。3 將滅了菌的試管取出并斜放（保證足夠的斜平面），待其冷卻凝固。接下來的步驟同培養(yǎng)皿的培養(yǎng)方法。注意事項：14和5步均為無菌實驗。2傳代培養(yǎng)周期為45天。實驗二 發(fā)酵種子培養(yǎng)一、實驗?zāi)康恼莆瞻l(fā)酵種子培養(yǎng)的原理和方法。二、實驗原理種子擴大培養(yǎng)簡稱種子擴培是發(fā)酵工程的一個

4、組成部分，其實指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。 其目的首先是出于接種量的需要與菌種的馴化，同時對于縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平也有幫助。所以種子擴大培養(yǎng)的任務(wù)是為了得到純而壯的培養(yǎng)物，即獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。 對于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長繁殖速度快慢決定種子擴大培養(yǎng)的級數(shù)。 抗生素生產(chǎn)中，放線菌的細胞生長繁殖較慢，常采用二級或三級種子擴大培養(yǎng)； 一般50t發(fā)酵罐多采用二級或三級發(fā)酵，有的也采用四級發(fā)酵如鏈霉素生產(chǎn)。種子擴培所得的純種培養(yǎng)物稱為種子。對于種子

5、而言，應(yīng)當(dāng)具備以下要求：總量及濃度能滿足要求；生理狀況穩(wěn)定，個體與群體區(qū)隔明顯；活力強，移種發(fā)酵后，能夠迅速生長；無雜菌污染。 種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡的確定受到諸多因素的影響，如果種齡過短則菌體太少，如果種齡過長，則菌體易老化。種子擴培的一般過程是：斜面菌種 一級種子培養(yǎng)（搖瓶） 二級種子培養(yǎng)(種子罐) 發(fā)酵 對于種子制備過程，其大致可區(qū)分為實驗室階段和生產(chǎn)車間階段，前期不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此將這一培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。而后期種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工

6、程上歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。并非所有的種子擴大培養(yǎng)都采用從搖瓶到種子罐的二級發(fā)酵模式，其實際發(fā)酵級數(shù)受到發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響。種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的區(qū)別：1種子培養(yǎng)基一般是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有微生物生長繁殖需要的基本營養(yǎng)物質(zhì)，微生物生長過程中不需在添加營養(yǎng)素、改變PH值的外界條件；2發(fā)酵培養(yǎng)基多為營養(yǎng)培養(yǎng)基，添加特殊營養(yǎng)成分，且發(fā)酵過程中要調(diào)PH值，溫度等外界條件。三、實驗器材1 菌種：金色鏈霉菌2 培養(yǎng)基（）：葡萄糖 4.2； 氯化鈉 0.2； 硫酸胺 0.3； 碳酸鈣 0.4； 硫酸鎂 0.025； 磷酸二氫鉀 0.025； ph 6.0。3

7、 試劑：蒸餾水4 其它：電子天平；三角瓶（250ml、100ml）；電爐；棉塞；牛皮紙；細繩；滅菌鍋；無菌操作臺；酒精燈；無菌吸管；搖床。四、實驗步驟1 按上述培養(yǎng)基配方配制50毫升培養(yǎng)基，裝入一只250毫升三角瓶中，加熱使藥品溶解后（保持低溫加熱），用棉塞塞住瓶口，并用牛皮紙扎緊，以備滅菌。2 用一個100毫升的三角瓶裝入蒸餾水，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮紙扎緊，以備滅菌。3 把物品放入滅菌鍋中在115 時滅菌1520分鐘，滅菌后放入已殺菌的無菌操作臺中。4 待培養(yǎng)基和無菌水冷卻至適宜溫度時，在無菌條件下，將兩支斜面的孢子用無菌水制成懸浮液，用無菌吸管吸1ml接入搖瓶的培養(yǎng)基中。5 將搖瓶放置

8、在29 、160 r/min 的搖床上培養(yǎng)2224小時。注意事項：1接種必須在無菌條件下進行。2 葡萄糖在超過115 的時候就會發(fā)生變性，滅菌時必須特別注意，要有人看護。實驗三 金霉素的發(fā)酵 一、實驗?zāi)康? 掌握搖瓶發(fā)酵的原理2 掌握搖瓶發(fā)酵的操作過程二、實驗原理1、發(fā)酵來源發(fā)酵現(xiàn)象早巳被人們所認(rèn)識，但了解它的本質(zhì)卻是近200年來的事。英語中發(fā)酵一詞fermentation是從拉丁語fervere派生而來的，原意為“翻騰”，它描述酵母作用于果汁或麥芽浸出液時的現(xiàn)象。沸騰現(xiàn)象是由浸出液中的糖在缺氧條件下降解而產(chǎn)生的二氧化碳所引起的。在生物化學(xué)中把酵母的無氧呼吸過程稱作發(fā)酵。我們現(xiàn)在所指的發(fā)酵早已

9、賦予了不同的含義。發(fā)酵是生命體所進行的化學(xué)反應(yīng)和生理變化，是多種多樣的生物化學(xué)反應(yīng)根據(jù)生命體本身所具有的遺傳信息去不斷分解合成，以取得能量來維持生命活動的過程。發(fā)酵產(chǎn)物是指在反應(yīng)過程當(dāng)中或反應(yīng)到達終點時所產(chǎn)生的能夠調(diào)節(jié)代謝使之達到平衡的物質(zhì)。實際上，發(fā)酵也是呼吸作用的一種，只不過呼吸作用最終生成CO2和水，而發(fā)酵最終是獲得各種不同的代謝產(chǎn)物。因而，現(xiàn)代對發(fā)酵的定義應(yīng)該是：通過微生物（或動植物細胞）的生長培養(yǎng)和化學(xué)變化，大量產(chǎn)生和積累專門的代謝產(chǎn)物的反應(yīng)過程。 2、發(fā)酵的定義 (1)微生物生理學(xué)嚴(yán)格定義的“發(fā)酵”： 有機物被生物體氧化降解成氧化產(chǎn)物并釋放能量的過程統(tǒng)稱為生物氧化。 微生物生理學(xué)把

10、生物氧化區(qū)分為呼吸和發(fā)酵，呼吸又可進一步區(qū)分為有氧呼吸和無氧呼吸。因此，發(fā)酵是生物氧化的一種方式。 發(fā)酵是這樣一種生物氧化方式：在沒有外源最終電子受體的條件下，化能異養(yǎng)型微生物細胞對能源有機化合物的氧化與內(nèi)源的（已經(jīng)經(jīng)過該細胞代謝的）有機化合物的還原相耦合，一般并不發(fā)生經(jīng)包含細胞色素等的電子傳遞鏈上的電子傳遞和電子傳遞磷酸化，而是通過底物（激酶的底物）水平磷酸化來獲得代謝能ATP；能源有機化合物釋放的電子的一級電子載體NAD，以NADH的形式直接將電子交給內(nèi)源的有機電子受體而再生成NAD，同時將后者還原成發(fā)酵產(chǎn)物（不完全氧化的產(chǎn)物）。 細胞中的NAD是有限的，如果作為一級電子載體的輔酶NAD不

11、能得到再生，就不能被回用，有效的電子載體就會愈來愈少，脫氫反應(yīng)就不能持續(xù)進行下去了。因此輔酶NAD的再生是生物氧化（包括發(fā)酵）繼續(xù)進行下去的必要條件。 (2) 專業(yè)詞匯“發(fā)酵（fermentation）” “發(fā)酵”這個詞匯在生活中往往是人聯(lián)想到發(fā)面制作大餅、油條、饅頭、包子，或者聯(lián)想到食品酸敗物品霉?fàn)€。 “發(fā)酵”作為專業(yè)詞匯其含義不但覆蓋發(fā)面制作大餅、油條、饅頭、包子，更重要的是指用發(fā)酵的手段工業(yè)化生產(chǎn)酒及酒精飲料、食品及食品添加劑、飼料及飼料添加劑、藥品、化工材料等等。(3)工業(yè)生產(chǎn)上定義的發(fā)酵“工業(yè)發(fā)酵” 工業(yè)生產(chǎn)上籠統(tǒng)地把一切依靠微生物的生命活動而實現(xiàn)的工業(yè)生產(chǎn)均稱為“發(fā)酵”。這樣定義的

12、發(fā)酵就是“工業(yè)發(fā)酵”。工業(yè)發(fā)酵要依靠微生物的生命活動，生命活動依靠生物氧化提供的代謝能來支撐，因此工業(yè)發(fā)酵應(yīng)該覆蓋微生物生理學(xué)中生物氧化的所有方式：有氧呼吸、無氧呼吸和發(fā)酵。 近百年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，發(fā)酵技術(shù)發(fā)生了劃時代的變革，已經(jīng)從利用自然界中原有的微生物進行發(fā)酵生產(chǎn)的階段進入到，按照人的意愿改造成具有特殊性能的微生物以生產(chǎn)人類所需要的發(fā)酵產(chǎn)品的新階段。 3、發(fā)酵的特點發(fā)酵和其他化學(xué)工業(yè)的最大區(qū)別在于它是生物體所進行的化學(xué)反應(yīng)。其主要特點如下： 1）發(fā)酵過程一般來說都是在常溫常壓下進行的生物化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)安全，要求條件也比較簡單。 2）發(fā)酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他農(nóng)副產(chǎn)品為主，

13、只要加入少量的有機和無機氮源就可進行反應(yīng)。微生物因不同的類別可以有選擇地去利用它所需要的營養(yǎng)?；谶@特性，可以利用廢水和廢物等作為發(fā)酵的原料進行生物資源的改造和更新。 3）發(fā)酵過程是通過生物體的自動調(diào)節(jié)方式來完成的，反應(yīng)的專一性強，因而可以得到較為單的代謝產(chǎn)物。 4）由于生物體本身所具有的反應(yīng)機制，能夠?qū)Ｒ恍缘睾透叨冗x擇性地對某些較為復(fù)雜的化合物進行特定部位地氧化、還原等化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，也可以產(chǎn)生比較復(fù)雜的高分子化合物。 5）發(fā)酵過程中對雜菌污染的防治至關(guān)重要。除了必須對設(shè)備進行嚴(yán)格消毒處理和空氣過濾外，反應(yīng)必須在無菌條件下進行。如果污染了雜菌，生產(chǎn)上就要遭到巨大的經(jīng)濟損失，要是感染了噬菌體，對

14、發(fā)酵就會造成更大的危害。因而維持無菌條件是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。 6）微生物菌種是進行發(fā)酵的根本因素，通過變異和菌種篩選，可以獲得高產(chǎn)的優(yōu)良菌株并使生產(chǎn)設(shè)備得到充分利用，也可以因此獲得按常規(guī)方法難以生產(chǎn)的產(chǎn)品。 7）工業(yè)發(fā)酵與其他工業(yè)相比，投資少，見效快，開可以取得顯著的經(jīng)濟效益。 基于以上特點，工業(yè)發(fā)酵日益引起人們重視。和傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝相比，現(xiàn)代發(fā)酵工程除了上述的發(fā)酵特征之外更有其優(yōu)越性。除了使用微生物外，還可以用動植物細胞和酶，也可以用人工構(gòu)建的“工程菌來進行反應(yīng)；反應(yīng)設(shè)備也不只是常規(guī)的發(fā)酵罐，而是以各種各樣的生物反應(yīng)器而代之，自動化連續(xù)化程度高，使發(fā)酵水平在原有基礎(chǔ)上有所提高和和創(chuàng)新。 4、發(fā)

15、酵的類型根據(jù)發(fā)酵的特點和微生物對氧的不同需要，可以將發(fā)酵分成若干類型： 1）按發(fā)酵原料來區(qū)分：糖類物質(zhì)發(fā)酵、石油發(fā)酵及廢水發(fā)酵等類型。 2）按發(fā)酵產(chǎn)物來區(qū)分：如氨基酸發(fā)酵、有機酸發(fā)酵、抗生素發(fā)酵、酒精發(fā)酵、維生素發(fā)酵等。 3）按發(fā)酵形式來區(qū)分，則有：固態(tài)發(fā)酵和深層液體發(fā)酵。 4）按發(fā)酵工藝流程區(qū)分則有：分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和流加發(fā)酵。 5）按發(fā)酵過程中對氧的不同需求來分，一般可分為：厭氧發(fā)酵和通風(fēng)發(fā)酵兩大類型。三、實驗器材 1 菌種：金色鏈霉菌2 培養(yǎng)基（）：葡萄糖 4.2；氯化鈉 0.2；硫酸胺 0.3；碳酸鈣 0.4；硫酸鎂 0.025；磷酸二氫鉀 0.025；pH 6.0。3 試劑：蒸餾水

16、4 其它：電子天平；三角瓶（500 ml）；紗布；牛皮紙；細繩；滅菌鍋；無菌操作臺；酒精燈；無菌吸管；搖床。四、實驗步驟1 按上述培養(yǎng)基配方配制50毫升培養(yǎng)基，裝入一只三角瓶中，加熱使藥品溶解，用紗布塞住瓶口，并用牛皮紙扎緊，以備滅菌。2 把物品放入滅菌鍋中在121下滅菌1520分鐘，滅菌后放入已殺菌的無菌操作臺中。3 用吸管從種子培養(yǎng)基將菌液接入滅菌后的培養(yǎng)基中，接種量為2 %4 將搖瓶放置在29 、160 r/min 的搖床上培養(yǎng)。5 定時取樣，以備后續(xù)測定。實驗四 發(fā)酵液中殘?zhí)橇康姆治鲆?、實驗?zāi)康模赫莆瞻l(fā)酵液中的殘?zhí)橇繙y定的原理和方法二、實驗原理本實驗葡萄糖含量的測定用DNS法。糖的測定

17、方法有物理的和化學(xué)的兩類。由于化學(xué)方法比較準(zhǔn)確，常常使用。還原糖的測定是糖測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基和酮基的糖類。單糖都是還原糖，利用單糖、雙糖和多糖的溶解度的不同可把它們分開。用酸水解法使沒有還原性的雙糖，徹底水解成具有還原性的單糖，再進行測定，就可以求出樣品中的還原糖的含量。有幾種方法可用于測定還原糖。在堿性溶液中，還原糖變?yōu)橄┒迹?，2-烯二醇）。烯二醇易被各種氧化劑如鐵氰化物，3，5-二硝基水楊酸和Cu+氧化為糖酸。鐵氰化物和二硝基水楊酸鹽的還原作用是還原糖定量測定的基礎(chǔ)。還原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色

18、的深淺程度與還原糖的量成正比。因此，我們可以測定樣品中還原糖的量。三、實驗器材1 待測溶液：發(fā)酵液。2 試劑：1) 3，5二硝基水楊酸（DNS） 把63克3，5二硝基水楊酸溶于262毫升2N的氫氧化鈉中，將此溶液與500毫升含有182克酒石酸鉀鈉的熱水混合，向該溶液中加入5克重蒸酚和5克亞硫酸鈉，充分?jǐn)嚢柚寥芙?，待溶液冷卻后，用水稀釋到100毫升，存儲于棕色瓶中。3 其它： pH試紙； 容量瓶（100ml）； 玻璃漏斗； 吸量管（01ml，1ml，05ml， 5ml，10ml）；試管；恒溫水??；沸水浴鍋。四、實驗步驟1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備1) 按下表制備九個管；2) 向九只試管中分別加入DNS

19、試劑，充分混合；3) 將九只試管放入沸水浴中加熱煮沸5分鐘；4) 將試管放入盛有冷水的燒杯中冷卻；5) 向試管中分別加入4毫升蒸餾水，充分混合；6) 以空白試管做對照，于540毫微米波長下，分別測定各管的OD值；7) 畫每管在540毫微米波長下的吸收值（作為縱坐標(biāo)），對每管所含的葡萄糖微克數(shù)（作為橫坐標(biāo)）的圖，得到一條通過零點的直線。 管號葡萄糖存儲液（1mg/ml）(ml)水（ml）最終濃度（g/ml）100.5020050.451003010.420040150.353005020.340060250.255007030.260080350.157009040.18008) 還原糖的測定（

20、1） 根據(jù)經(jīng)驗，將樣品稀釋N倍，使稀釋液中的葡萄糖含量在011mg/ml的范圍之內(nèi)；（2） 取蒸餾水1ml，稀釋液1ml，DNS1.5ml加入試管中；（3） 在沸水浴中煮沸5分鐘；（4） 在冰水浴中迅速冷卻；（5） 用比色管定容到5ml；（6） 以參比做比較，在分光光度計上540nm測定去其OD值。參比的操作為（2）步中將稀釋液用蒸餾水代替。3根據(jù)還原糖的OD值，使用葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算殘?zhí)橇俊?實驗五 金霉素含量的測定 一、實驗?zāi)康恼莆战鹈顾睾康臏y定原理和操作過程二、實驗原理 金霉素在440nm下具有吸光度，通過測定發(fā)酵液中金霉素吸光度的變化，比較金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計算出發(fā)酵液中金

21、霉素的含量。三、實驗器材 1 不同時間的金霉素發(fā)酵液2 試劑：蒸餾水；固體草酸；2mol/LHCl。3 其它：電子天平；三角瓶（100ml）；燒杯（50ml）；恒溫水浴鍋；容量瓶（50ml）；分光光度計；pH試紙；吸管。四、實驗步驟金霉素含量的測定1 取發(fā)酵液50ml左右。2 加入固體草酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH在1.21.4之間，過濾。3 取適量濾液，稀釋100倍。4 取1ml稀釋液加入5 ml 2mol/L的HCl。5 100 水浴5 min，定容到50 ml；對照樣品不加熱。6 440nm測定吸光度。7 對比標(biāo)準(zhǔn)曲線計算金霉素含量。金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線實驗六 發(fā)酵罐的熟悉及滅菌操作（一）發(fā)酵罐的熟悉一

22、、裝置介紹1 簡介 本次試驗所用FUS-15L生物反應(yīng)器是一個精心設(shè)計、精密加工裝配而成的生物反應(yīng)系統(tǒng)，總?cè)莘e15L，工作容積10.5升，能精確的測量溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、PH值和溶解氧濃度，并能精確的控制溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和PH值。配備有自動消泡裝置及輸送料液的蠕動泵系統(tǒng)。機械攪拌裝置位于罐蓋上部，采用機械密封結(jié)構(gòu)，具有可靠的抗污染密封性能。氣體過濾器，具有過濾效率高、流量大、阻力小、能耐重復(fù)蒸氣消毒（耐蒸氣消毒溫度140），能有效而可靠地慮出空氣中雜菌，而且體積小，安裝更換方便等優(yōu)點；主要管路均采用“O”型密封圈結(jié)構(gòu)的連接方式，可有效地防止因泄漏而導(dǎo)致發(fā)生污染。該裝置由罐體、管路系統(tǒng)、自動控制系統(tǒng)三

23、大部分組成，安裝、拆卸、清潔方便，容易維修保養(yǎng)。2 反應(yīng)器特性21 概述 反應(yīng)器采用不銹鋼材制成，經(jīng)機械加工、精細拋光后，內(nèi)、外壁表面粗糙度不大于0.8um。設(shè)計壓力為0.2Mpa。反應(yīng)器工作溫度125，反應(yīng)器攪拌功率為185W，轉(zhuǎn)速為1501000 rpm,攪拌器型式為兩檔六平葉拆卸式渦輪漿。加熱器加熱功率為750KW。22 罐體（1） 罐體的總?cè)莘e15L，工作容積體10.5升。（2） 罐高(H)為445mm，罐徑（D）為200mm，高徑比H:D為2:2.1。（3） 罐體夾套裝有進出水口各一個，用于培養(yǎng)過程中恒溫水、冷卻水的循環(huán)或進、處，以及高溫滅菌時蒸汽加熱、保溫的進、出。（4） 罐體夾套

24、右側(cè)上方裝有壓力表，便于觀察蒸汽滅菌及補充冷水時夾套內(nèi)的壓力變化。（5） 罐體的下部右側(cè)有兩個直徑25的標(biāo)準(zhǔn)電極插孔，用于安裝進口或國產(chǎn)的PH及DO電極。（6） 罐體正面裝有矩形視鏡，背面配有圓形燈鏡和專用照明燈具，以便于觀察罐內(nèi)培養(yǎng)液的情況與葉面上部的其它空間。（7） 取樣放料閥位于罐體下部，與蒸汽管道連接，可反復(fù)消毒滅菌。開啟和關(guān)閉采用手動順時針和逆時針的旋轉(zhuǎn)方式。該閥門可以在培養(yǎng)過程中作為取樣閥又可以在放料過程中作為放料閥。（8） 攪拌器為兩檔六平葉拆卸式渦輪漿。（9） 反應(yīng)器內(nèi)壁裝有可拆卸的4塊擋板，以增強培養(yǎng)過程中的混合效果。（10） 罐體下部裝有單管氣體分布器，消毒滅菌時可以通入蒸

25、汽。培養(yǎng)過程可通入無菌空氣。（11） 罐體背面上部裝有排氣管道并與冷凝器連接，用于培養(yǎng)過程中的排氣冷凝。23 罐蓋罐蓋用不銹鋼材料制成，有“O”型密封圈與罐體法蘭密封。罐蓋的兩側(cè)裝有可拆卸的手柄。在罐蓋中心裝有攪拌器動力輸出的“軸系總成”四周分布有9個開孔(見圖1 ).該9個孔的用途分別為：其中通用接口b有6個，均為插針式接口，可用于補料、換液和酸、堿、消泡劑的加入及備用，并以硅橡膠墊圈與注射式密封針頭及壓帽互相銜接。連接硅橡膠管的注射式密封針頭和壓帽可分別單獨滅菌。之后，在火焰保護下插入即可。這里值得注意的是：在接種的時候打開接種口a進行接種操作時，由于開孔口徑較大易于排氣，致使罐內(nèi)壓力跌零

26、。此時應(yīng)加大通氣量，使罐內(nèi)始終保持正壓狀態(tài)，同時，須使接種口處于火焰保護狀態(tài)。操作時動作要快，時間不宜過長，避免因操作因素造成污染。接口b也可以作為壓差式接種的接種口，接種完畢應(yīng)用消毒酒精棉封住接種口，并旋上螺口蓋帽。二、反應(yīng)器管路系統(tǒng)1 管路系統(tǒng)流程示意圖2管路系統(tǒng)閥門標(biāo)記一覽表序號代號名稱1G-01氣體調(diào)節(jié)閥2G-02濾器進氣閥3G-03無菌空氣閥4S-01濾器消毒閥5S-02夾套蒸汽閥6S-03底閥消毒閥7S-04濾器排氣閥8S-05蒸汽濾氣排水閥9W-01水泵進口閥10W-02冷水旁路閥11W-03水泵出口閥12W-04沖洗閥13W-05夾套回流閥14W-06冷凝水閥15M-01排料取

27、樣閥3 閥門功能簡介（1）氣體調(diào)節(jié)閥該閥為裝于流量計上的針型閥，用于培養(yǎng)過程中開啟、關(guān)閉空氣及調(diào)節(jié)空氣的流量。球浮子的中部最大處是為空氣流量讀數(shù)。（2）濾器進氣閥消毒霉菌是關(guān)閉此閥以防止蒸汽通入空氣流量計；消毒結(jié)束或進入培養(yǎng)階段時，關(guān)閉S-01閥，開啟此閥，使空氣經(jīng)過過濾器通入罐內(nèi)。（3）無菌空氣閥此閥用于將過濾后的無菌空氣經(jīng)氣體分布器通入罐內(nèi)。培養(yǎng)過程中，若遇到臨時停電、停氣等故障時，先關(guān)閉此閥，既可保證罐內(nèi)正壓有能防止罐壓急劇下降造成培養(yǎng)液倒流現(xiàn)象。（4）尾氣排氣閥消毒時調(diào)節(jié)排氣量以控制罐內(nèi)溫度和壓力。培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)尾氣流量以維持罐壓（保持進氣和排氣的平衡）。（5）濾器消毒閥消毒時關(guān)閉G-

28、02閥，開啟此閥，蒸汽通入過濾器進行消毒，同時將蒸汽經(jīng)過過濾器通入罐內(nèi)。（6）夾套蒸汽閥消毒時開啟此閥和W-11閥，關(guān)閉W-02，W-03和W-05閥，蒸汽通過夾套，對罐內(nèi)培養(yǎng)基進行預(yù)熱，防止在蒸汽直接通入罐內(nèi)培養(yǎng)基中時由于產(chǎn)生過多的冷凝水而造成培養(yǎng)基體積增加。（7）底閥消毒閥 消毒時，開啟此閥和M-01,對取樣、放樣閥（底閥）及取樣管道進行滅菌。（8）濾氣排氣閥消毒時排去過濾器中的冷凝水，又可在培養(yǎng)過程中防止可能出現(xiàn)的回流管道的倒流現(xiàn)象出現(xiàn)。（9）蒸汽過濾器排水閥使用前開啟此閥，排去冷凝水。（10）水泵進口閥發(fā)酵過程中用于循環(huán)泵往夾套通入循環(huán)水的閥門，消毒時關(guān)閉此閥以防止蒸汽進入泵內(nèi)。（11

29、）冷水旁路閥當(dāng)水泵出現(xiàn)故障時，開啟此閥，保證管路系統(tǒng)充滿水。（12）水泵出水閥消毒時，關(guān)閉此閥，防止蒸汽進入水泵；快速冷卻或培養(yǎng)過程中，開啟此閥，冷凝水由水泵進入夾套，進行溫度控制。發(fā)酵過程中用于循環(huán)泵往夾套通入循環(huán)水的閥門，消毒時關(guān)閉此閥以防止蒸汽進入泵內(nèi)。（13）沖洗閥培養(yǎng)過程結(jié)束后，用皮管連接此閥，可對反應(yīng)器內(nèi)、外及環(huán)境進行沖洗。（14）夾套回流閥消毒時，關(guān)閉此閥，防止蒸汽經(jīng)加熱器進入水泵；快速冷卻或培養(yǎng)過程中，開啟此閥，冷卻水或恒溫水經(jīng)加熱器排入下水道或通入水泵進行循環(huán)以控制溫度。（15）冷凝水閥消毒或培養(yǎng)過程中，為減少培養(yǎng)液的損失，可開啟此閥對排氣進行冷卻，使冷凝液返回罐內(nèi)。（16）

30、加熱器底閥快速冷卻或排污時，將加熱器內(nèi)的水排入下水道。（17）溫控切換閥在培養(yǎng)過程中，開啟此閥。而一旦溫控電磁閥W-09失靈時，可關(guān)閉此閥，打開或關(guān)閉W-10，即可維持手動冷卻控溫，又可對W-09進行維修或更換。（18）溫控電磁閥培養(yǎng)過程中，當(dāng)罐內(nèi)溫度高于設(shè)定值時，自控系統(tǒng)開啟此閥，冷卻水加入夾套并流經(jīng)此閥，使溫度恒溫。（19）溫控旁路閥培養(yǎng)過程中，關(guān)閉此閥。而一旦溫控電磁閥W-09出現(xiàn)故障時，關(guān)閉W-08，開啟此閥，可代替W-09閥，進行手動冷卻控溫。（20）夾套排污閥用于排放夾套內(nèi)的水進入下水道。亦可在S-05閥下面的疏水器出現(xiàn)故障時，排放夾套內(nèi)的冷凝水。（21）排料排氣閥消毒時，開啟此閥

31、，蒸汽形成回路，對取樣放料閥（底閥）及取樣管路進行消毒，罐內(nèi)液體由此口排放。（22） 底閥對取樣放料閥（底閥）和取樣管路消毒結(jié)束后，關(guān)閉此閥，防止由于冷卻時，取樣管路內(nèi)壓力劇降，出現(xiàn)倒吸（抽真空）現(xiàn)象而產(chǎn)生污染。（二）發(fā)酵罐的滅菌操作簡介：反應(yīng)器的消毒滅菌在微生物發(fā)酵培養(yǎng)過程中非常重要，前期污染的主要原因就是消毒不徹底，為確保培養(yǎng)過程在無污染的情況下進行，必須嚴(yán)格按實罐消毒滅菌程序進行操作。反應(yīng)器的消毒滅菌分為實消和冷卻兩步進行。（一） 實消步驟1、 關(guān)閉所有閥門。2、 向罐內(nèi)注入待消毒的料液至一定體積（消后體積控制在10L）3、 打開電源總開關(guān)，及“攪拌”開關(guān)，并設(shè)置一定的攪拌速度（宜在20

32、0rpm左右）。4、 將控制機箱面板上的“手動/自動”開關(guān)處于關(guān)閉狀態(tài)（即控制器處于檢測狀態(tài)）。5、 開啟尾氣排氣閥G-04和冷凝水閥W-06。6、 開啟夾套蒸汽閥S-02、蒸汽慮氣排水閥S-05，將蒸汽（約0.3-0.4Mpa）通入夾套，預(yù)熱罐內(nèi)液體。7、 當(dāng)罐內(nèi)溫度達到8595左右時，開啟濾器消毒閥S-01、濾氣排氣閥S-04，關(guān)閉冷凝水閥W-06，使蒸汽通入過濾器，并經(jīng)由濾器排氣閥S-04和疏水器排放過濾器中的冷凝水。8、 待過濾器中的冷凝水排盡后，（觸摸濾器排氣閥S04下端的管子燙手即可），關(guān)閉濾器排氣閥S-04，然后開啟無菌空氣閥G-03，使蒸汽通入罐內(nèi)。9、 當(dāng)溫度高于100時，罐

33、內(nèi)產(chǎn)生鼓泡翻騰，此時應(yīng)關(guān)閉“攪拌”開關(guān)停止攪拌。蒸汽經(jīng)排氣冷凝器通過尾氣排放閥G-04向外排放。此時應(yīng)調(diào)節(jié)尾氣排氣閥G-04到至略有少量蒸汽排出即可。10、 當(dāng)罐內(nèi)溫度上升至121（0.11Mpa），適當(dāng)開啟底閥消毒閥S-03、排料取樣閥M-01，使少量蒸汽經(jīng)過排料取樣閥M-01排出，由“活”蒸汽對取樣放料管路進行消毒滅菌。待排放適當(dāng)時間后（約20分鐘），先關(guān)閉排料取樣閥M-01和底閥消毒閥M-03。11、 通過調(diào)節(jié)夾套蒸汽閥G-04、尾氣排放閥S-02或蒸汽進量，使反應(yīng)器保溫、保壓（121，0.11Mpa）30分鐘，實消工作即告完成。注意：在消毒滅菌過程中切記：（1）相關(guān)管道或區(qū)域均應(yīng)有蒸汽

34、的進和出，使蒸汽形成活路，不能留有死角。（2）經(jīng)常開啟濾器排氣閥S-04，排放過濾器中的冷凝水，隨后即關(guān)閉此閥。（3）當(dāng)罐內(nèi)溫度超過121時，應(yīng)盡量減少蒸汽進量，關(guān)閉或關(guān)小夾套蒸汽閥S-02，而不應(yīng)加大排氣，以免液體攜帶而導(dǎo)致液體體積減少。（4）液體體積在實消結(jié)束后，會出現(xiàn)增加或減少現(xiàn)象，這是在消毒過程中由于蒸汽的冷凝或攜帶造成的。（5）在消毒滅菌過程中應(yīng)盡量避免蒸汽壓力劇跌，一旦蒸汽壓力低于罐內(nèi)壓力，罐內(nèi)液體會倒壓進入管道和過濾器內(nèi)。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，應(yīng)盡快關(guān)閉底閥消毒閥S-03，防止料液倒壓入過濾器內(nèi)。（二）冷卻步驟當(dāng)實消滅菌結(jié)束后，應(yīng)關(guān)閉底閥消毒閥S-03、切斷蒸汽源，開啟“攪拌”開關(guān)，

35、待壓力降至0.8Mpa左右時充入氣體方可冷卻，否則易造成罐內(nèi)壓力劇降，出現(xiàn)罐壓跌零甚至倒吸現(xiàn)象，由此而帶來污染。具體步驟如下：1、 檢查空氣源并將進入裝置的空氣壓力調(diào)節(jié)至0.120.14Mpa，開啟“攪拌”開關(guān)（200rpm左右）。2、 開啟冷凝水閥W06.3、 按下列順序關(guān)閉各閥門：(1)無菌空氣閥G03;(2)排料取樣閥M01;(3)底閥消毒閥S03;(4)濾器消毒閥S01;(5)夾套蒸汽閥S-02。4、 按下列順序開啟各閥門，將無菌空氣通入罐內(nèi)：1) 氣體調(diào)節(jié)閥G01;2) 濾器進氣閥G02;3) 無菌空氣閥G-03。注意：待罐內(nèi)壓力降至0.08Mpa左右時，方可開啟無菌空氣閥G-03，

36、避免罐壓高于空氣壓力造成倒壓。5、 調(diào)節(jié)空氣調(diào)節(jié)閥G-01和尾氣排放閥G-04，保持一定的罐壓。（0.05Mpa）6、 罐內(nèi)通入無菌空氣后關(guān)閉夾套排水閥S05,開啟下列各閥,和機箱面板上的分路控制開關(guān)，即可進行快速冷卻：(1)水泵出口閥W03;(2)夾套回流閥W05;(3)溫控切換閥W08;(4)“冷卻”開關(guān);(5)“水泵”開關(guān)。注意：在冷卻過程中罐壓的波動比較大，須密切注意觀察，切不可使罐壓跌零。1、 當(dāng)罐溫降至接近培養(yǎng)工藝所需的設(shè)定溫度（相差約34）時，將溫度手動控制切換成自動控制，具體步驟為：2、 (1)關(guān)閉機箱面板上的“冷卻”開關(guān)；3、 (2)將機箱面板上的“手動/自動”開關(guān)處于開啟狀

37、態(tài)，此時，控制器處于自動控制狀態(tài)；溫度達到培養(yǎng)工藝所需的設(shè)定值時，消毒滅菌全過程完畢；4、 (3)按工藝要求，設(shè)置工藝所需各個參數(shù)，待接種。注意：冷卻過程中空氣流量不要過大，攪拌速度可適當(dāng)降低，并嚴(yán)格控制罐壓，以防泡沫攜帶量過多。實驗七 木聚糖的發(fā)酵生產(chǎn)1、 實驗?zāi)康?. 了解木聚糖酶；2.熟悉影響真菌產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件；3.掌握發(fā)酵實驗的基本操作。2、 實驗原理木聚糖酶,英文名稱xylanase，半纖維素酶系中最主要的組成部分。是一類組成比較復(fù)雜的的酶，是一種多聚五碳糖，并和纖維素分子存在著氫鍵連接和物理混合。狹義上的木聚糖酶指的是內(nèi)切-1，4-木聚糖酶，廣義上木聚糖酶的主要功能是降解木聚

38、糖分子，主要包括內(nèi)切-1，4-木聚糖酶（endo-1，4-D-xylanase,EC3.2.1.8）-D-葡萄糖醛酸苷酶（-D-glucuronidases，EC3.2.239）- D-木糖苷酶（( - xylanxylohydrolase , EC3. 2. 1.37）- L - 呋喃型阿拉伯糖苷酶（-L-arabinofuranosidases）酚酸酯酶。其中主要降解木聚糖分子的是內(nèi)切-1，4-木聚糖酶，此酶主要是通過內(nèi)切木聚糖主鏈的- 1 ,4 - 木糖苷鍵，降解木聚糖主鏈骨架27，使木聚糖分子降解成低木聚糖分子，并生成少量的木糖。低木聚糖分子則在- D - 木糖苷酶的催化下，末端釋放出

39、木糖殘基。木聚糖酶的來源廣泛，而且由于其組成不同，結(jié)構(gòu)也很復(fù)雜。根據(jù)組成木聚糖酶的分子量不同，可以將木聚糖酶劃分為高分子量木聚糖酶和低分子量木聚糖酶。高分子量木聚糖酶一般含有269809個氨基酸殘基，而低分子量木聚糖酶氨基酸氨基大約在182234個。也可將木聚糖酶按照是否具有底物特異性將其分為特異性木聚糖酶和非特異性木聚糖酶。三、實驗器材1菌種：純綠青霉2基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麥麩3 g，酵母粉0.2 g，硫酸鎂0.01 g，氯化鈉0.05 g，磷酸二氫鉀0.05 g，定容到1000 ml。121滅菌30min。3其它：電子天平；250ml三角瓶；電爐；滅菌鍋；培養(yǎng)皿（5個）；試管；無菌操作臺；酒精

40、燈；接種環(huán)；涂布棒；報紙；細繩；棉塞；牛皮紙；玻璃棒。四、 實驗步驟1、按上述培養(yǎng)基配方配制100毫升培養(yǎng)基，裝入一只250毫升三角瓶中，加熱使藥品溶解后（保持低溫加熱），用棉塞塞住瓶口，并用牛皮紙扎緊，以備滅菌。2、用一個100毫升的三角瓶裝入蒸餾水，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮紙扎緊，以備滅菌。3、把物品放入滅菌鍋中在121 時滅菌20分鐘，滅菌后放入已殺菌的無菌操作臺中。4、待培養(yǎng)基和無菌水冷卻至適宜溫度時，在無菌條件下，將兩支斜面的孢子用無菌水制成懸浮液，用無菌吸管吸1ml接入搖瓶的培養(yǎng)基中。5、將搖瓶放置在29 、160 r/min 的搖床上培養(yǎng)2224小時。在無菌條件下，菌株接種到基礎(chǔ)

41、產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶中，放置28，轉(zhuǎn)速160r/min恒溫培養(yǎng)搖床上振蕩培養(yǎng)5d。實驗八 木聚糖酶活力測定方法木聚糖酶能夠?qū)⒛揪厶撬獬赡咎堑倪€原糖類，這些還原糖能夠與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)這個原理可用來測定木聚糖酶的活性。本實驗利用木聚糖（生化試劑）為底物，加入一定量的粗酶液反應(yīng)一段時間后加入DNS，沸水浴5 min鐘后，利用721可見光分光光度計測反應(yīng)后的OD值。本實驗中，酶活越高，水解木聚糖生成的還原糖越多，其OD值也會跟著增加，通過定義酶活含義，可以測定出酶活，判斷酶活的高低。1木聚糖的制備稱取50 g麥麩放入燒杯中，按1：10的料液比加入蒸餾水和一定量NaOH，維持pH在10左右，加熱煮沸30 min，冷卻后在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取離心后的上層液體，按1：2的體積比加入乙醇溶液，沉淀30 min，再在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，將得到的沉淀洗滌至中性，烘干，得到的即為木聚