第三章發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)和方法

1、Developmental Biology第三章第三章 發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)和發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)和方法方法Developmental Biology 在第一章回顧發(fā)育生物學(xué)的歷史時(shí)，我們已了解了實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)發(fā)育生物學(xué)發(fā)展的突出貢獻(xiàn)，特別是分子生物學(xué)的興起給發(fā)育生物學(xué)的發(fā)展所帶來(lái)的活力。事實(shí)上，發(fā)育生物學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的學(xué)科，很多重要的發(fā)育理論和發(fā)育模型都是在大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。其中涉及各種各樣的研究技術(shù)和方法，既有傳統(tǒng)的胚胎學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法，如胚胎移植、胚胎分割、細(xì)胞核移植等，又有新發(fā)展的分子生物學(xué)方法，如顯微注射、原位雜交,基因轉(zhuǎn)移及基因功能分析等。本章將重點(diǎn)介紹發(fā)育生物學(xué)研究中的幾

2、種常用方法 Developmental Biology 第一節(jié)第一節(jié) 顯微注射顯微注射 顯微注射(microinj ection)是發(fā)育生物學(xué)研究中最經(jīng)典而又使用最為普遍的一種方法，特別是近十幾年來(lái)通過(guò)基因轉(zhuǎn)移創(chuàng)造生物反應(yīng)器這一具有明顯商業(yè)價(jià)值的應(yīng)用研究的開(kāi)展，更顯現(xiàn)出這一技術(shù)的活力。本節(jié)將介紹顯微操作系統(tǒng)、注射用卵子或胚胎的準(zhǔn)備、操作過(guò)程等。Developmental Biology 一顯微操作系統(tǒng) 顯微操作系統(tǒng)已經(jīng)歷了多次更新和發(fā)展?，F(xiàn)今普遍使用的顯微操作器一般由帶熒光或相差的倒顯微操作器一般由帶熒光或相差的倒置顯微鏡、顯微操作臂、注射器及玻璃微吸管、，置顯微鏡、顯微操作臂、注射器及玻璃微

3、吸管、，攝像裝置和計(jì)算機(jī)圖像處理裝置等組成攝像裝置和計(jì)算機(jī)圖像處理裝置等組成。為了配制一個(gè)性能優(yōu)良的用于發(fā)育生物學(xué)研究的顯微操作系統(tǒng)，雖有許多必須考慮的因素，但由于現(xiàn)在普遍采用的顯微操作系統(tǒng)一般都是配套購(gòu)置，且都具有詳細(xì)的說(shuō)明書，因而這里就不詳述。有興趣者還可參考有關(guān)文獻(xiàn)。Developmental Biology 二、顯微注射步驟二、顯微注射步驟 1注射用卵母細(xì)胞的制備注射用卵母細(xì)胞的制備 在魚類和兩棲類動(dòng)物中，卵母細(xì)胞可采用兩種方法獲得，一是將動(dòng)物麻醉后，通過(guò)解剖取出卵巢一是將動(dòng)物麻醉后，通過(guò)解剖取出卵巢葉葉(兩棲動(dòng)物兩棲動(dòng)物)，或用挖卵器從泄殖孔取出所需要，或用挖卵器從泄殖孔取出所需要的

4、卵母細(xì)胞；另一種方法是殺死動(dòng)物，取出全部的卵母細(xì)胞；另一種方法是殺死動(dòng)物，取出全部卵巢。對(duì)哺乳動(dòng)物而言，一般通過(guò)超數(shù)排卵卵巢。對(duì)哺乳動(dòng)物而言，一般通過(guò)超數(shù)排卵(superovulation)獲得更多的卵母細(xì)胞，即模擬體獲得更多的卵母細(xì)胞，即模擬體內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育與排放的激素調(diào)節(jié)模式，通過(guò)注內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育與排放的激素調(diào)節(jié)模式，通過(guò)注射不同的促性腺激素，刺激暫時(shí)處于休眠狀態(tài)的射不同的促性腺激素，刺激暫時(shí)處于休眠狀態(tài)的卵母細(xì)胞進(jìn)入成熟發(fā)育期，成熟后排放到輸卵管卵母細(xì)胞進(jìn)入成熟發(fā)育期，成熟后排放到輸卵管中。中。由此可以獲得的卵母細(xì)胞遠(yuǎn)多于自然排卵。下面以兩棲動(dòng)物爪蟾為例，簡(jiǎn)要介紹制備卵母細(xì)胞的這兩種方法

5、的基本步驟。Developmental Biology (1)取出完整卵巢及卵母細(xì)胞的培養(yǎng)取出完整卵巢及卵母細(xì)胞的培養(yǎng) (2)取出卵巢葉及卵母細(xì)胞的培養(yǎng)取出卵巢葉及卵母細(xì)胞的培養(yǎng) 2注射用胚胎的制備注射用胚胎的制備 3.顯微注射顯微注射 在開(kāi)始注射之前，應(yīng)準(zhǔn)備好所有試劑和器在開(kāi)始注射之前，應(yīng)準(zhǔn)備好所有試劑和器具。具。Developmental BiologyDevelopmental Biology第二節(jié)胚胎原位雜交第二節(jié)胚胎原位雜交 一全胚原位雜交一全胚原位雜交 全胚原位雜交全胚原位雜交(whole mount insuite hybridization，WISH)是廣泛用于胚胎發(fā)育是廣泛用

6、于胚胎發(fā)育調(diào)控基因表達(dá)研究的一種技術(shù)。近年來(lái)該調(diào)控基因表達(dá)研究的一種技術(shù)。近年來(lái)該技術(shù)發(fā)展較快，不僅可以檢測(cè)到較弱的雜技術(shù)發(fā)展較快，不僅可以檢測(cè)到較弱的雜交信號(hào)，而且可以多色雜交，檢測(cè)多個(gè)基交信號(hào)，而且可以多色雜交，檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)情況。因的表達(dá)情況。Developmental Biology 全胚原位雜交的基本原理全胚原位雜交的基本原理: 是用各種標(biāo)記物標(biāo)記與體內(nèi)特定是用各種標(biāo)記物標(biāo)記與體內(nèi)特定mRNA互互補(bǔ)的補(bǔ)的RNA分子分子(反義反義RNA)，以它們作為探，以它們作為探針與動(dòng)物的整體胚胎進(jìn)行原位雜交，然后針與動(dòng)物的整體胚胎進(jìn)行原位雜交，然后用相應(yīng)的抗體來(lái)檢測(cè)特異探針的分布情況。用相應(yīng)的

7、抗體來(lái)檢測(cè)特異探針的分布情況。以下以爪蟾胚胎為例介紹全胚原位雜交的以下以爪蟾胚胎為例介紹全胚原位雜交的操作步驟。其他動(dòng)物的全胚原位雜交與爪操作步驟。其他動(dòng)物的全胚原位雜交與爪蟾基本相同。蟾基本相同。Developmental Biology (一一)單色全胚原位雜交單色全胚原位雜交 1原位雜交試劑原位雜交試劑 2操作步驟操作步驟 (1)探針制備探針制備 (2)胚胎的固定與保存胚胎的固定與保存 (3)原位雜交原位雜交 (4)洗脫和檢測(cè)洗脫和檢測(cè) Developmental Biology(二二)雙色全胚熒光原位雜交雙色全胚熒光原位雜交 用用2種不同的標(biāo)記物種不同的標(biāo)記物(DIG-11-dUTP，

8、生物，生物素一素一11一一dUTP等等)分別標(biāo)記分別標(biāo)記2個(gè)探針，同時(shí)個(gè)探針，同時(shí)與胚胎雜交，然后對(duì)兩個(gè)探針?lè)謩e用相應(yīng)與胚胎雜交，然后對(duì)兩個(gè)探針?lè)謩e用相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。的抗體進(jìn)行檢測(cè)。 在雙色全胚原位雜交中，探針的制備、胚胎的固定雜交及洗脫方法與單色原位雜交步驟相同，只是檢測(cè)方法有所不同。兩次加入不同的抗體進(jìn)行兩次顯色。 Developmental Biology二胚胎組織切片原位雜交二胚胎組織切片原位雜交 原位雜交是研究胚胎基因表達(dá)的常用方法。原位雜交是研究胚胎基因表達(dá)的常用方法。雖然全胚原位雜交簡(jiǎn)單易行，但在許多情雖然全胚原位雜交簡(jiǎn)單易行，但在許多情況下，該方法還達(dá)不到研究的要求，因而況

9、下，該方法還達(dá)不到研究的要求，因而需要在胚胎的組織切片上進(jìn)行雜交。在胚需要在胚胎的組織切片上進(jìn)行雜交。在胚胎的組織切片上雜交的有利因素在于不存胎的組織切片上雜交的有利因素在于不存在探針不能滲入到胚胎內(nèi)部的問(wèn)題。在探針不能滲入到胚胎內(nèi)部的問(wèn)題。Developmental Biology第三節(jié)第三節(jié) 胚胎免疫組織化學(xué)技術(shù)胚胎免疫組織化學(xué)技術(shù) 一用途：一用途：胚胎免疫組織化學(xué)是定位胚胎免疫組織化學(xué)是定位胚胎內(nèi)的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的一種有胚胎內(nèi)的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的一種有效方法。效方法。該技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，如果該技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，如果和其他一些免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合使用，可和其他一些免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合使用，可以快速獲

10、得相關(guān)蛋白質(zhì)功能的有關(guān)信以快速獲得相關(guān)蛋白質(zhì)功能的有關(guān)信息。息。 Developmental Biology 二胚胎免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理：二胚胎免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理： 是用某種蛋白質(zhì)免疫其他動(dòng)物是用某種蛋白質(zhì)免疫其他動(dòng)物(通常為鼠或通常為鼠或兔兔)而獲得相應(yīng)的抗體而獲得相應(yīng)的抗體(初級(jí)抗體初級(jí)抗體)，再用初，再用初級(jí)抗體免疫另一種動(dòng)物，獲得次級(jí)抗體。級(jí)抗體免疫另一種動(dòng)物，獲得次級(jí)抗體。在次級(jí)抗體上偶聯(lián)上一種酶在次級(jí)抗體上偶聯(lián)上一種酶(如堿性磷酸化如堿性磷酸化酶酶)，構(gòu)成免疫復(fù)合物。將胚胎與初級(jí)抗體，構(gòu)成免疫復(fù)合物。將胚胎與初級(jí)抗體結(jié)合后，洗去多余的抗體，再與免疫復(fù)合結(jié)合后，洗去多余

11、的抗體，再與免疫復(fù)合物結(jié)合。最后利用顯色反應(yīng)來(lái)確定胚胎內(nèi)物結(jié)合。最后利用顯色反應(yīng)來(lái)確定胚胎內(nèi)特定蛋白質(zhì)的表達(dá)位置。特定蛋白質(zhì)的表達(dá)位置。本節(jié)以爪蟾胚胎為例介紹胚胎蛋白質(zhì)免疫組織化學(xué)檢測(cè)的操作方法。Developmental Biology 三操作方法三操作方法 1實(shí)驗(yàn)所需溶液 2爪蟾胚胎免疫組織化學(xué)檢測(cè) (1)胚胎固定 (2)漂白 (3)免疫檢測(cè) (4)胚胎切片 Developmental Biology第四節(jié)發(fā)育基因的啟動(dòng)子分析第四節(jié)發(fā)育基因的啟動(dòng)子分析 一。一。用途 啟動(dòng)子調(diào)控作用分析是研究胚胎發(fā)育基因功能的一種重要方法，特別在研究基因時(shí)空表達(dá)的分子機(jī)制方面，更是有突出的作用。通常，啟動(dòng)子

12、分析包括基因特異調(diào)控序列、啟動(dòng)子(promoter)和增強(qiáng)子元件(enhancer element)的鑒別，它們都是基因轉(zhuǎn)錄活性的重要調(diào)控單元。 Developmental Biology 二。原理：二。原理： 啟動(dòng)子分析的第一步是將一系列啟動(dòng)子分析的第一步是將一系列大小不同的啟動(dòng)大小不同的啟動(dòng)子的片段子的片段克隆到含有報(bào)告基因克隆到含有報(bào)告基因(reporter gene)的載的載體中，然后通過(guò)比較這一缺失系列中啟動(dòng)子的活體中，然后通過(guò)比較這一缺失系列中啟動(dòng)子的活性，找到啟動(dòng)子中具有調(diào)控能力的序列。隨后，性，找到啟動(dòng)子中具有調(diào)控能力的序列。隨后，將被鑒定出來(lái)的調(diào)控序列分為更小的片段，并亞將被

13、鑒定出來(lái)的調(diào)控序列分為更小的片段，并亞克隆到含有異源活性啟動(dòng)子克隆到含有異源活性啟動(dòng)子(如單純皰疹病毒胸苷如單純皰疹病毒胸苷激酶基因啟動(dòng)子激酶基因啟動(dòng)子)和報(bào)告基因的載體中，再次比較和報(bào)告基因的載體中，再次比較缺失系列啟動(dòng)子的活性，以確定調(diào)控序列中的最缺失系列啟動(dòng)子的活性，以確定調(diào)控序列中的最關(guān)鍵序列。最后，可通過(guò)野生型啟動(dòng)子中單個(gè)堿關(guān)鍵序列。最后，可通過(guò)野生型啟動(dòng)子中單個(gè)堿基的點(diǎn)突變，進(jìn)一步確定基因的關(guān)鍵調(diào)控元件基的點(diǎn)突變，進(jìn)一步確定基因的關(guān)鍵調(diào)控元件(圖圖32)。Developmental Biology 有多種方法可用于體內(nèi)(in vivo)啟動(dòng)子分析，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、顯微注射等，在不同的

14、動(dòng)物中可選用不同的方法，但比較而言，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物法較為費(fèi)時(shí)，而且需要一些特殊條件，而顯微注射法較為簡(jiǎn)單。本節(jié)將以斑馬魚胚胎中g(shù)oosecoid基因啟動(dòng)子分析為例介紹啟動(dòng)子的定性和定量分析方法。Developmental BiologyDevelopmental Biology 1. 實(shí)驗(yàn)所需試劑實(shí)驗(yàn)所需試劑 2分散囊胚細(xì)胞中的啟動(dòng)子分析分散囊胚細(xì)胞中的啟動(dòng)子分析 3完整胚胎中啟動(dòng)子的定量分析完整胚胎中啟動(dòng)子的定量分析 4整體胚胎中啟動(dòng)子空間活性分析整體胚胎中啟動(dòng)子空間活性分析 Developmental Biology第五節(jié)第五節(jié) 基因表達(dá)的核糖核酸酶保護(hù)基因表達(dá)的核糖核酸酶保護(hù)分析分析一一 應(yīng)

15、用：核糖核酸酶應(yīng)用：核糖核酸酶(RNase)保護(hù)實(shí)驗(yàn)是保護(hù)實(shí)驗(yàn)是定量分析基因轉(zhuǎn)錄水平的常用方法之一，定量分析基因轉(zhuǎn)錄水平的常用方法之一，它對(duì)它對(duì)mRNA的分析具有的分析具有靈敏度高靈敏度高(比比Northern雜交和點(diǎn)雜交靈敏雜交和點(diǎn)雜交靈敏810倍倍)、特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。另外，核糖核酸酶保的特點(diǎn)。另外，核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)還可用于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定、護(hù)實(shí)驗(yàn)還可用于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定、內(nèi)含子外顯子邊界的確定、選擇性剪內(nèi)含子外顯子邊界的確定、選擇性剪接接(alternative splicing)分析及確定轉(zhuǎn)入分析及確定轉(zhuǎn)入到胚胎中的核酸的降解率等方面的研究。到胚胎中的核酸的降解率等方面的研

16、究。Developmental Biology核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)的基本原理是：核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)的基本原理是：將待分析的目標(biāo)將待分析的目標(biāo)DNA序列作為模板，用序列作為模板，用逆轉(zhuǎn)錄的方法合成與之互補(bǔ)的放射性標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄的方法合成與之互補(bǔ)的放射性標(biāo)記的探針。將此探針加入到記的探針。將此探針加入到RNA混合物混合物中后，它便可與目標(biāo)中后，它便可與目標(biāo)RNA雜交，形成雙雜交，形成雙鏈鏈RNA。由于該雙鏈對(duì)核糖核酸酶具有。由于該雙鏈對(duì)核糖核酸酶具有抵抗力，因此，雜交體系中未雜交的樣抵抗力，因此，雜交體系中未雜交的樣品品RNA及過(guò)量的探針全部被核糖核酸及過(guò)量的探針全部被核糖核酸酶消化，只剩下雜交形成的雙鏈

17、酶消化，只剩下雜交形成的雙鏈RNA。核糖核酸酶失活后，通過(guò)凝膠電泳和放核糖核酸酶失活后，通過(guò)凝膠電泳和放射自顯影檢測(cè)被保護(hù)的射自顯影檢測(cè)被保護(hù)的RNA探針的量，探針的量，即即RNA樣品中目標(biāo)樣品中目標(biāo)RNA的量的量。 Developmental Biology 1實(shí)驗(yàn)用試劑實(shí)驗(yàn)用試劑 2操作步驟操作步驟 (1)胚胎總胚胎總RNA提取提取 (2)RNA探針的合成和純化探針的合成和純化 (3)雜交和雜交和RNA酶消化酶消化Developmental BiologyDevelopmental Biology第六節(jié)第六節(jié) 抑制性差減雜交技術(shù)抑制性差減雜交技術(shù) 一一.應(yīng)用：應(yīng)用： 抑制性差減雜交抑制性差

18、減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)最早見(jiàn)于最早見(jiàn)于1996年年6月月Clontech公司、加州大學(xué)舊金山分校和俄羅斯公司、加州大學(xué)舊金山分校和俄羅斯科學(xué)院合作的研究報(bào)道科學(xué)院合作的研究報(bào)道(Diatchenko et a1 .996)，是一種簡(jiǎn)便而高效的通過(guò)比較兩種總是一種簡(jiǎn)便而高效的通過(guò)比較兩種總mRNA，而，而克隆只存在于其中一種總克隆只存在于其中一種總mRNA中特異表達(dá)產(chǎn)物中特異表達(dá)產(chǎn)物的新方法。的新方法。例如可以快速?gòu)牟煌?xì)胞系、不同組例如可以快速?gòu)牟煌?xì)胞系、不同組織間或同一細(xì)胞系、同一組織在不同條件下織間或同一細(xì)胞系、同一組

19、織在不同條件下(如發(fā)如發(fā)育時(shí)間的差異、病理性差異等育時(shí)間的差異、病理性差異等)克隆出差別表達(dá)基克隆出差別表達(dá)基因。因。Developmental Biology 二二.原理原理 是以抑制是以抑制PCR為基礎(chǔ)的為基礎(chǔ)的DNA差減雜交。抑差減雜交。抑制制PCR是利用是利用DNA鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，比鏈間退火更穩(wěn)定的特點(diǎn)，使非目的火，比鏈間退火更穩(wěn)定的特點(diǎn)，使非目的系列片段兩端反向重復(fù)系列在退火時(shí)產(chǎn)生系列片段兩端反向重復(fù)系列在退火時(shí)產(chǎn)生類似于類似于“鍋一柄鍋一柄”的結(jié)構(gòu)，無(wú)法與引物配的結(jié)構(gòu)，無(wú)法與引物配對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增。同

20、時(shí)，該方法運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)增。同時(shí)，該方法運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理，即高豐度的單鏈原理，即高豐度的單鏈cDNA在退火時(shí)產(chǎn)生在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度要快于低豐度的單鏈同源雜交的速度要快于低豐度的單鏈cDNA，從而使原來(lái)在豐度上有差別的單鏈從而使原來(lái)在豐度上有差別的單鏈cDNA相相對(duì)含量達(dá)到基本一致。對(duì)含量達(dá)到基本一致。 Developmental Biology 三三.SSH基本過(guò)程是：基本過(guò)程是： 抽提抽提2種不同細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的種不同細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的mRNA分別作分別作為檢測(cè)樣本為檢測(cè)樣本(tester)和參照樣本和參照樣本(driver)，反轉(zhuǎn)錄成，反轉(zhuǎn)錄成cDN

21、A，用用Rsa I或或Hae III酶切，以產(chǎn)生大小適當(dāng)?shù)钠筋^末端酶切，以產(chǎn)生大小適當(dāng)?shù)钠筋^末端cDNA片段，將片段，將tester cDNA分成均等的分成均等的2份，各自接上份，各自接上2種接種接頭，與過(guò)量的頭，與過(guò)量的driver cDNA變性后退火雜交。變性后退火雜交。第一次雜交第一次雜交后有后有4種產(chǎn)物：種產(chǎn)物： (a)tester cDNA，(b)自身退火的自身退火的tester cDNA雙鏈，雙鏈，(c)是是tester和和driver的異源雙鏈，的異源雙鏈，(d)是是driver cDNA。第一次雜交的目的是實(shí)現(xiàn)。第一次雜交的目的是實(shí)現(xiàn)tester單鏈單鏈cDNA均等化均等化(n

22、ormalization)，即使原來(lái)有豐度差別的單鏈，即使原來(lái)有豐度差別的單鏈cDNA的的相對(duì)含量達(dá)到基本一致，相對(duì)含量達(dá)到基本一致，由于由于tester cDNA中與中與drivercDNA。序列相似的片段大都和。序列相似的片段大都和driver cDNA形成異形成異源雙鏈分子源雙鏈分子(c)，使，使tester cDNA中的差異表達(dá)基因的目中的差異表達(dá)基因的目標(biāo)標(biāo)cDNA得到大量富集。第一次雜交后，合并得到大量富集。第一次雜交后，合并2份雜交產(chǎn)物，份雜交產(chǎn)物，再加上新的變性再加上新的變性driver單鏈，再次退火雜交，此時(shí)，只有單鏈，再次退火雜交，此時(shí)，只有第一次雜交后經(jīng)均等化和扣除的單鏈

23、第一次雜交后經(jīng)均等化和扣除的單鏈tester cDNA和和driver cDNA一起形成各種雙鏈分子，這次雜交進(jìn)一步富集了差一起形成各種雙鏈分子，這次雜交進(jìn)一步富集了差異表達(dá)基因的異表達(dá)基因的cDNA，產(chǎn)生了一種新的雙鏈分子，產(chǎn)生了一種新的雙鏈分子(e)，它的，它的2個(gè)個(gè)5端有端有2個(gè)不同的接頭，正由于這個(gè)不同的接頭，正由于這2個(gè)不同的接頭，使個(gè)不同的接頭，使其在以后的其在以后的PCR中被有效地?cái)U(kuò)增中被有效地?cái)U(kuò)增(圖圖33)。 Developmental BiologyDevelopmental BiologyDevelopmental Biology 操作過(guò)程 1實(shí)驗(yàn)中所需試劑 2實(shí)驗(yàn)步驟

24、（1）RNA的提取 （2）Driver和Tester cDNA的制備 雙鏈cDNA的合成 Rsa1消化 Driver cDNA的制備 （3）差減雜交 （4）PCR擴(kuò)增 （5）差減文庫(kù)的構(gòu)建及差減基因的克隆 Developmental Biology三、控制發(fā)育的基因的鑒定三、控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測(cè)方法及其表達(dá)和功能檢測(cè)方法Developmental BiologyDevelopmental Biology(一一)、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；育的基因；分離時(shí)空特異性表達(dá)基

25、因的方法；分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子間的相互作用克隆新的利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因?；颉evelopmental Biology從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因隱性突變；隱性突變；半顯性突變；半顯性突變；顯性突變顯性突變突變體的類型突變體的類型Developmental Biology從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因突變類型圖示突變類型圖示Developmental Biology從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因自然群體中的突變體；自然群體中的突變體；化學(xué)誘變劑處理，如亞硝基

26、乙脲乙亞硝基脲化學(xué)誘變劑處理，如亞硝基乙脲乙亞硝基脲 (N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)；外源外源DNA插入法，如插入法，如DNA注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座子利用等；子利用等；X射線或射線或 r射線照射射線照射獲得突變體的方法獲得突變體的方法Developmental Biology從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因隱性突變體的鑒定方法隱性突變體的鑒定方法化學(xué)誘變法化學(xué)誘變法Developmental Biology 由含 GFP 基因的反轉(zhuǎn)錄病毒插入引起突變 正常胚胎 突變胚胎 X 基因GFP 基因 完整的 X 基

27、因使胚胎正常發(fā)育 X 基因被 GFP 基因破壞后胚胎異常發(fā)育從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因DNA插入誘變法插入誘變法Developmental BiologyExpression of GFP in virus-infected fishTransientgermline從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因DNA插入誘變法插入誘變法Developmental BiologyAn example of mutational phenotypes從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因DNA插入誘變法插入誘變法Developmental Biology從自然或人工突變體中分離鑒

28、定控制發(fā)育的基因Genetic mapping and chromosomal walking；PCR or Southern hybridization；Candidate cloning；Differential display/subtractive cloning從突變體克隆基因的方法從突變體克隆基因的方法Developmental Biology分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法獲取特定組織：直接取材或轉(zhuǎn)基因法取材；獲取特定組織：直接取材或轉(zhuǎn)基因法取材；構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫(kù)；文庫(kù)；從蛋白質(zhì)到基因；從蛋白質(zhì)到基因；Differentiatial hybridization/different

29、ial display/subtractive cloningDevelopmental Biology分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法基因芯片/核酸雜交法Developmental BiologySubtractive cloning分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法Developmental Biology利用基因序列同源性的克隆法用一個(gè)物種的基因直接做探針?lè)蛛x另一個(gè)物種的同源基因；根據(jù)多個(gè)物種的蛋白序列分離另一個(gè)物種的同源基因；根據(jù)同一基因家族的不同成員間的保守序列分離新的家族成員；Developmental Biology利用大分子間的相互作用克隆新的基因鑒定可與蛋白質(zhì)結(jié)合的鑒定可與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列序列分離靶蛋白質(zhì)，（可采用分離靶蛋白質(zhì)，（可采用gel-shift assay)克隆靶蛋白的表達(dá)基因?？寺“械鞍椎谋磉_(dá)基因。利用利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用與蛋白質(zhì)間的相互作用Developmental Biology分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法利用蛋白