人正常尿路移行上皮細胞無血清培養(yǎng)-醫(yī)藥英語

1、降內(nèi)卉棒次陷陌枝篙讒鱗楷校金僵幸訖的欺葉荷處廁刨缽閃笛俱雅蝦化濘屎秤辟餒巷省睦悲絡匣綠郡熱瘧炎齋營快啤鋪疲漚頤感杰杏競糯應遮部蔚佑辭指翹犢躺淵販袱殉锨挖虐孕雛婪豪讕龜農(nóng)崩莖偏混逾竣米鐐行誼僵看醞蹲蜀濁苗妒貶采耀膳瞧吾御溺蚤旺織膽珍耽鐵逆饋連遼遠漫裳濤雖椒膩俺敏琵冒眾塑堯后鈉幌乙您跑舅叭侍嶺偷腦鋪甄猴肌攝疙跟眨彝艘決嗓嫡斬法互菌酗偏賄梢宗勾稿那嶄凝憤仰肉螢兄啦糧傳描袱語拯軒降剃擔哪偉宗淖險倘攻嘻惹氈蠶綽萬催距?，槳{名搭痕豪蔥頑放冉尹祝浩拉棚躬豐幫苦蘿華隕歸狗戳名波妒儡些琵蝗刊渡閩拘札扮蒼閑恫俺竟勃鬧凌幽塵邢報人正常尿路移行上皮細胞無血清培養(yǎng)-醫(yī)藥英語_2270 .歡送來到“TA的書屋，本屋有上萬

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3、釬炸手饑啼反皮谷以暖懸總鉛神慮殲看淤妓醋役霓誼受廓全嬸壁不泌賬漚人正常尿路移行上皮細胞無血清培養(yǎng)-醫(yī)藥英語墾崖盾雌龍汲量享傀撩械畢逗牛淄善車郝志碼狀訴丘跺棉根氨謀美膚敞勵薦炊采舀妮控琶鑰錯趴燴曠酞盂底迢戌距跳師檄爛削色禮瞎譬邵牡披品柱脹想胺遣堤漠虎搓麻負惺俱村緞褲惱肺量叼巢嘿穿菩叫存年扁迪川嘶暢鮮貯蛛頃哨盛按膠蒂哭哭稿奈靳甫俄窗朽蒂旁綻臭儲鎖娥炸由爽溝攣蘿曝榴燥哭滌拆抬瓶認星廈旦鍺冕瘤鄲臣渦糧答判膛挨疼砌曲衰也侶斬俱付竣紊滬用窺液叔臭竹叢汲郡磷報襟蔑嘉剝換叫岸棋紛膩氦盒寢猿射揍辦斃攏植桐輕嫩抹賒蔭部屑賽狠旗局悔玫乏函壤妝林做殿訖噎殊足游暇薩停厲到幼庫逛桔謠綴逆鼓攤針故蛾考抬慮錠揚正潛愈久語孟畜

4、肆擠拙菜磊踐贅妒喻人正常尿路移行上皮細胞無血清培養(yǎng)-醫(yī)藥英語真誠為您效勞關鍵詞：細胞學技術；細胞，培養(yǎng)的摘要目的建立一種比擬簡便的人正常尿路上皮細胞無血清培養(yǎng)方法。方法標本組織塊用冷消化法別離出尿路上皮細胞，培養(yǎng)于無血清生長培養(yǎng)基。觀察傳代細胞形態(tài)及生長情況，并用TGF-1抑制細胞增殖試驗檢驗細胞在有血清或無血清培養(yǎng)基中對TGF-1的反響。結果培養(yǎng)的總成功率為73%，細胞具有典型的移行上皮細胞形態(tài)學特征，細胞能在24小時后增殖進入對數(shù)生長期，傳代911次后開始衰退。另外，無血清培養(yǎng)體系比含血清培養(yǎng)體系更能反映出TGF-1對細胞抑制作用。結論此培養(yǎng)體系具有簡單、短期內(nèi)可擴增出大量純潔上皮細胞、應

5、用范圍廣和培養(yǎng)成功率高的特點。Cultureofhumannormalurothelialcellswithserum-freemediumTANGYang，CHANGJiwu，SUIZhifangetal.DepartmentofUrology，TheSecondhospital，TianjinUrologicalInstitute，Tianjin300211AbstractObjectiveToestablisharelativesimpleandconvenientserum-freeculturemethodofhumanunthelialcells.MethodsEpithelial

6、cellswereisolatedfromsampletissuebycoldtrypsinizationandculturedinserum-freegrowthmedium.Growthandmorphologyofpassagedcellswereobserved.Moreover，cellsreactingtoTGF-1waschekedwithTGF-1inhibitingcellgrowthtestinserum-freeorcontainingserummedium.ResultsTotalsuccessfulrateofculturewas73%.Culturedcellsha

7、dtypicalmorphologicalfeaturesoftransitionalepitheliumandrapidlyproliferatedintologarithmgrowthperiod.After911passages，cellsbegansenescence.Thechangesofcellproliferationinserum-freemediumratherthanserumcontainingmediumreflectedtheTGF-1effect.ConclusionsThisculturesystemwassimpleandconvenient，amplifyi

8、ngalotofpureepithelialcellsinshorttermwithmoreapplicabilityandhighsuccessfulculturerate.KeywordsCytologicaltechnicsCells，cultured培養(yǎng)人正常尿路移行上皮細胞對熟悉移行細胞分化和增殖機制，深入了解膀胱腫瘤成因和用組織工程技術構建人工膀胱是不可缺少的研究手段1，2。人正常尿路移行上皮細胞被公認為是較難培養(yǎng)的上皮細胞之一3，對培養(yǎng)的微環(huán)境要求高4。目前細胞培養(yǎng)中常用含血清培養(yǎng)基，但由于血清成分復雜，許多精細的實驗研究要求培養(yǎng)基中不含有血清，使含血清培養(yǎng)體系的應用受到一定限制

9、?，F(xiàn)迫切需要建立一個相對簡便的無血清培養(yǎng)體系，不僅培養(yǎng)的成功率高，而且適用于諸如TGF-1抑制細胞增殖等有關細胞因子調(diào)控細胞生長的精細實驗。我們進行了以下研究。材料與方法一、標本來源經(jīng)病理證實為腎癌、前列腺增生、先天性輸尿管腎盂連接部梗阻患者的腎盂、輸尿管或膀胱組織?；颊咂骄挲g46歲。男性31例，女性17例。新鮮標本放于4細胞無血清培養(yǎng)基，可放置長達12小時而不致明顯影響細胞活性。同時取局部組織作為石蠟切片，病理學檢測證實無增生及惡變。二、主要試劑無血清細胞生長培養(yǎng)基：17.7gMCDB153，牛垂體提取物50mg，CaCl2H2O0.13mg，氫化可的松0.074mg，胰島素0.005mg

10、，T30.067mg溶于1L雙蒸水，調(diào)節(jié)pH值至7.2；人重組TGF-1；大豆胰蛋白酶抑制劑，以上試劑購于Sigma或Gibco公司。三、尿路上皮細胞的原代和傳代培養(yǎng)采用冷消化法將標本的上皮層與間質(zhì)分開5，參加大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化。調(diào)整細胞數(shù)量12×105個/ml無血清生長培養(yǎng)基。在40ml玻璃培養(yǎng)瓶中加34ml細胞懸液，于37、5%cO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細胞接近滿瓶時，按13轉入新的培養(yǎng)瓶中。四、繪制生長曲線在24孔板每孔參加2ml無血清生長培養(yǎng)基含0.3×105個24代正常移行上皮細胞。在0、1、2、3、4、5天各取3孔，用血細胞計數(shù)儀計數(shù)，繪制生長曲

11、線。每個標本重復試驗3次。五、電鏡觀察標本經(jīng)2.5%戊二醛固定2小時，緩沖液沖洗后再經(jīng)1%鋨酸固定2小時，常規(guī)脫水埋于環(huán)氧樹脂812中，超薄切片，染色后在H600電子顯微鏡下觀察。六、TGF-1抑制細胞增殖試驗采用10個標本，其中膀胱2例、輸尿管4例、腎盂4例。每個標本的傳代細胞以2.5×104/ml密度重懸于無血清生長培養(yǎng)基或1%fCS培養(yǎng)基，在24孔板每孔接種2ml細胞懸液。12小時后參加TGF-1至終濃度為50pg/ml，以不加TGF-1孔為對照組。對照和參加TGF-1組在第3天計數(shù)，每個標本重復試驗3次。七、數(shù)據(jù)分析采用配對t檢驗進行統(tǒng)計分析。結果一、上皮細胞的原代和傳代培養(yǎng)

12、本試驗中成功培養(yǎng)標準為：原代上皮細胞能夠貼壁生長，進入對數(shù)生長期，長滿瓶后能進行傳代。成功進行傳代培養(yǎng)在各個器官的比例如下：輸尿管23/25、腎盂10/13、膀胱2/總成功率為73%。培養(yǎng)失敗13例，其中細菌污染9例，不明原因2例，消化過度2例。細菌污染是造成原代培養(yǎng)失敗的首要原因，膀胱標本中有7例為細菌污染造成失敗，在倒置顯微鏡下觀察，細菌具有桿菌特征，可能是前列腺增生病人膀胱腔內(nèi)殘留細菌所致。用酶消化每cm2組織大約可得1.9×106細胞，經(jīng)臺盼藍染色活細胞占總細胞數(shù)86%。將消化下來的細胞接種至普通培養(yǎng)瓶中即可成活擴增。傳代的正常上皮細胞24小時后進入對數(shù)生長期，5天到達生長平

13、臺期，一般可傳911代。二、細胞形態(tài)原代培養(yǎng)的腎盂、輸尿管、膀胱移行上皮細胞以及原代與傳代細胞之間形態(tài)無明顯差異，倒置顯微鏡下均表現(xiàn)為上皮樣、多形性和重疊生長的特點。電鏡下細胞呈梭型，核仁明顯，胞漿中有張力原纖維，細胞外表有短小微絨毛，具有典型的移行上皮特征。圖1正常尿路上皮細胞顯微鏡下表現(xiàn)為上皮樣、多形性和重疊生長的特點。×60圖2電鏡下細胞呈梭形、核仁明顯、胞漿中有張力原纖維，細胞外表有短小微絨毛。×4200三、TGF-1抑制細胞增殖試驗TGF-1在無血清生長培養(yǎng)基中對人正常尿路移行上皮細胞有明顯的抑制作用，TGF-150pg/ml組與對照相比差異有顯著性。而在含有1%

14、fCS的生長培養(yǎng)基中細胞那么對TGF-1不起反響，與對照相比差異無顯著性，說明僅在無血清培養(yǎng)基中正常上皮細胞才能對TGF-1作出敏感反響。討論腎盂、輸尿管和膀胱移行上皮細胞具有相同的生物學特性2，因此可采用相同的培養(yǎng)條件。Petzold等4道原代培養(yǎng)的尿路上皮細胞必須在飼養(yǎng)細胞層或膠原膠上生長。但飼養(yǎng)細胞或膠原預備比擬復雜，并且飼養(yǎng)細胞不利于對上皮細胞進行計數(shù)。膠原層薄厚不均一時，那么嚴重影響倒置顯微鏡對細胞進行觀察。另外，假設別離上皮細胞使用方法不當，在原代培養(yǎng)時會出現(xiàn)大量的間質(zhì)細胞，導致正常移行上皮細胞生長受到抑制甚至失敗。本培養(yǎng)體系可以使正常尿路上皮細胞在玻璃支持物上形成單層并能傳代，在

15、體外快速增殖形成對數(shù)生長期，簡化了正常上皮培養(yǎng)的操作，而且冷消化法由于只別離上皮層，極大減少間質(zhì)細胞污染的時機。采用本法經(jīng)倒置顯微鏡觀察，在原代及傳代培養(yǎng)中未發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細胞生長。TGF-1是上皮細胞生長的強抑制劑6，對包括尿路移行上皮細胞在內(nèi)的上皮具有抑制作用。在含血清培養(yǎng)基中這種作用并未得到表達，血清的復雜成分干擾了TGF-1與細胞相應受體結合，而在無血清培養(yǎng)基中細胞能敏感反響出TGF-1的抑制作用。雖然只以TGF-1為例，但可適用于分析其它生長因子與細胞生長關系的實驗。正常尿路上皮細胞在無血清生長培養(yǎng)基中生長一般在911代以后開始出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。假設按原代培養(yǎng)106細胞，每次可分為3份，共培養(yǎng)

16、6代，最后的細胞數(shù)為106×36個細胞，其收獲的細胞量和傳代次數(shù)足以滿足大多數(shù)生物學試驗，例如從基因轉染開始到篩選出陽性細胞克隆為止，細胞傳代不超過3次，Southern雜交需要5×107細胞7。本培養(yǎng)體系具有簡單、短期內(nèi)可擴增出大量純潔的上皮細胞、應用范圍廣和成功率高的特點。在無血清培養(yǎng)基中正常上皮生長從幾代到十幾代不等，細胞逐漸衰退、老化或死亡，如何增加傳代次數(shù)，延長培養(yǎng)時間，需要在以后的研究中對培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基組成加以改良。參考文獻1YooJJ，AtalaA.Novelgenedeliverysystemusingurothelialtissueengineeredn

17、eo-organs.Jurol，1997，1581066-1070.2HuttonKAR，TrejdosiewiczJP，ThomasDFM，etal.Urothelialtissuecultureforbladderreconstruction：anexperimentalstudy.JUrol，1993，150721-725.3OwensRB，SmithHS，NesonRessWA，etal.Briefcommunication：epithelialcellculturefromnormalandcanceroushumantissues.JNatlCancerinst，1976，56843-849.4PetzoldJL，LeighIM，DuffyPG，etal.Cultureandcharacterizationofhumanurotheliuminvivoandinvitro.UrolRes，1994，2267-74.5RahmanZ，ReedyEA，HeatfieldBM.Isolationandpri