ABI Solid Sequencing

1、ABI SOLid SequencingSolid技術(shù)Solid測(cè)序技術(shù)是ABI公司于2007年開始投入用于商業(yè)測(cè)序應(yīng)用的儀器。它基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過程之中測(cè)序。它的原理是： 圖a. Solid測(cè)序技術(shù)1.DNA文庫構(gòu)建片段打斷并在片段兩端加上測(cè)序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。2.Emulsion PCRSolid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um。在擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的3端進(jìn)行修飾，這是為下一步的測(cè)序過程作的準(zhǔn)備。3修飾的微珠會(huì)被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中

2、，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測(cè)序區(qū)域（圖a）。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。3.連接酶測(cè)序這一步是Solid測(cè)序的獨(dú)特之處。它并沒有采用以前測(cè)序時(shí)所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3-XXnnnzzz-5。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖a）。這個(gè)8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類

3、的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測(cè)序法，兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，相當(dāng)于一次能決定兩個(gè)堿基。這種測(cè)序方法也稱之為兩堿基測(cè)序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對(duì)而連接上時(shí)，就會(huì)發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號(hào)，圖a和圖b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號(hào)后，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割，這樣就能移除熒光信號(hào)，以便進(jìn)行下一個(gè)位置的測(cè)序。不過值得注意的是，通過這種測(cè)序方法，每次測(cè)序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位在測(cè)到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n-1進(jìn)行第二輪測(cè)

4、序。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對(duì)的位置上相差一個(gè)堿基（圖a. 8）。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測(cè)序位置往3端移動(dòng)一個(gè)堿基位置，因而就能測(cè)定第0、1位和第5、6位第二輪測(cè)序完成，依此類推，直至第五輪測(cè)序，最終可以完成所有位置的堿基測(cè)序，并且每個(gè)位置的堿基均被檢測(cè)了兩次。該技術(shù)的讀長在2×50bp，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次檢測(cè)，這一技術(shù)的原始測(cè)序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%，而15x覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確性更是達(dá)到了99.999%，應(yīng)該說是目前第二代測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，因而一旦發(fā)生錯(cuò)誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯(cuò)

5、誤。 圖b. Solid測(cè)序技術(shù)新一代測(cè)序技術(shù)-SOLiD (ABI)SOLiD工作流程a. 文庫制備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板：片段文庫(fragment library)或配對(duì)末端文庫(mate-paired library)。使用哪一種文庫取決于你的應(yīng)用及需要的信息。片段文庫就是將基因組DNA打斷，兩頭加上接頭，制成文庫。如果你想要做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RNA定量、miRNA探索、重測(cè)序、3, 5-RACE、甲基化分析、ChIP測(cè)序等，就可以用它。如果你的應(yīng)用是全基因組測(cè)序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排/拷貝數(shù)，則需要用配對(duì)末端文庫。配對(duì)末端文庫是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接，再

6、環(huán)化，然后用EcoP15酶切，使中間接頭兩端各有27bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫。b. 乳液PCR/微珠富集在微反應(yīng)器中加入測(cè)序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行乳液PCR（Emulsion PCR）。PCR完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng)過3修飾，可以與玻片共價(jià)結(jié)合?？吹竭@里，是不是有一種似曾相識(shí)的感覺呢？那就對(duì)了，此步驟與454的GS FLX基本相同。不過SOLiD系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1 um。乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”，基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有

7、反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，這個(gè)DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增加，PCR反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。c. 微珠沉積3修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測(cè)序區(qū)域。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。d. 連接測(cè)序這一步可就是SOLiD的獨(dú)

8、門秘笈了。它的獨(dú)特之處在于沒有采用慣常的聚合酶，而用了連接酶。SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。探針3端15位為隨機(jī)堿基，可以是ATCG四種堿基中的任何一種堿基，其中第1、2位構(gòu)成的堿基對(duì)是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對(duì)和4種探針顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系，而35位的“n”表示隨機(jī)堿基，68位的“z”指的是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基。單向SOLiD測(cè)序包括五輪測(cè)序反應(yīng)，每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)

9、。第一輪測(cè)序的第一次連接反應(yīng)由連接引物“n”介導(dǎo)，由于每個(gè)磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板，所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測(cè)序儀記錄下探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學(xué)處理斷裂探針3端第5、6位堿基間的化學(xué)鍵，并除去68位堿基及5末端熒光基團(tuán)，暴露探針第5位堿基5磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。因?yàn)榈谝淮芜B接反應(yīng)使合成鏈多了5個(gè)堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到模板上第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息幾個(gè)循環(huán)之后，引物重置，開始第二輪的測(cè)序。由于第二輪連接引物n-1比第一輪錯(cuò)開一位，所以第二輪得到以0，1位起始的若干堿基對(duì)的顏色

10、信息。五輪測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、1位，第1、2位. 的順序把對(duì)應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0，1，2，3”組成的SOLiD原始顏色序列。e. 數(shù)據(jù)分析SOLiD測(cè)序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。理論上來說，按照“雙堿基編碼矩陣”，只要知道所測(cè)DNA序列中任何一個(gè)位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡并特性（一種顏色對(duì)應(yīng)4種堿基對(duì)），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起“連鎖解碼錯(cuò)誤”，改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基。和其它所有測(cè)序儀一樣，測(cè)序錯(cuò)誤在所難

11、免，關(guān)鍵是對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤的評(píng)價(jià)和后續(xù)處理。由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測(cè)序過程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，提供內(nèi)在的校對(duì)功能。這樣，雙保險(xiǎn)確保了SOLiD系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%，是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。為避免“連鎖解碼錯(cuò)誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序列，而是依靠reference序列進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。SOLiD序列分析軟件首先根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把reference堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列，然后與SOLiD原始顏色序列進(jìn)行比較，來獲得S

12、OLiD原始顏色序列在reference的位置，及兩者的匹配性信息。Reference轉(zhuǎn)換而成的顏色編碼序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有兩種情況：“單顏色不匹配”和“兩連續(xù)顏色不匹配”。由于每個(gè)堿基都被獨(dú)立地檢測(cè)兩次，且SNP位點(diǎn)將改變連續(xù)的兩個(gè)顏色編碼，所以一般情況下SOLiD將單顏色不匹配處理成測(cè)序錯(cuò)誤，這樣一來，SOLiD分析軟件就完成了該測(cè)序錯(cuò)誤的自動(dòng)校正；而連續(xù)兩顏色不匹配也可能是連續(xù)的兩次測(cè)序錯(cuò)誤，SOLiD分析軟件將綜合考慮該位置顏色序列的一致性及質(zhì)量值來判斷該位點(diǎn)是否為SNP。系統(tǒng)可擴(kuò)展性SOLiD系統(tǒng)采用開放玻片式的結(jié)構(gòu)，使用包被DNA樣品的微珠來輸入基因組信息。微

13、珠密度并不是一成不變的，系統(tǒng)支持更高密度的微珠富集。開放式玻片形式、微珠富集、以及軟件算法的結(jié)合，能使平臺(tái)輕松升級(jí)到更高的通量，而無需對(duì)基礎(chǔ)技術(shù)和配置做重大改變。這也是SOLiD系統(tǒng)平均每季度將通量擴(kuò)大一倍的原因所在。無以倫比的通量目前SOLiD 3系統(tǒng)單次運(yùn)行能產(chǎn)生50 GB的人基因組序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的17倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺(tái)新一代測(cè)序系統(tǒng)都無法達(dá)到的。今年初，ABI公司和貝勒醫(yī)學(xué)院人類基因組測(cè)序中心（HGSC）的科學(xué)家總結(jié)了他們?cè)谇嘶蚪M計(jì)劃首次數(shù)據(jù)發(fā)布中的貢獻(xiàn)。作為商業(yè)參與者以及與HGSC共同協(xié)作，ABI公司利用SOLiD系統(tǒng)產(chǎn)生了超過460 GB可作圖的序列數(shù)據(jù)，比這兩

14、個(gè)機(jī)構(gòu)的預(yù)定目標(biāo)高出了65%。而通量的升高也有望進(jìn)一步降低基因組測(cè)序的費(fèi)用，成本只需1萬美元的人類基因組測(cè)序指日可待。最大的靈活性SOLiD 3系統(tǒng)具有兩個(gè)獨(dú)立的流動(dòng)室，讓用戶能在一臺(tái)SOLiD分析儀中運(yùn)行兩個(gè)完全獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)同時(shí)提供兩套儀器。玻片也能分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)小室。而20個(gè)條形碼序列則提供了額外的靈活性，顯著增加了定向重測(cè)序、表達(dá)和ChIP分析的經(jīng)濟(jì)性。目前最多能同時(shí)運(yùn)行320個(gè)樣品（2×8×20）。至此，SOLiD系統(tǒng)已不再是一臺(tái)單純的測(cè)序儀，而是成為功能更全面的基因分析儀。除了測(cè)序和重測(cè)序，還能進(jìn)行全基因表達(dá)圖譜分析、SNP、microRNA、ChIP、甲基化

15、等多種分析。全基因表達(dá)圖譜分析芯片大概是目前應(yīng)用最廣泛的從全局角度分析基因表達(dá)整體模式的方法。然而，基于雜交技術(shù)的微陣列技術(shù)只限用于已知序列，無法檢測(cè)新的mRNA；而且雜交技術(shù)靈敏度有限，難以檢測(cè)低豐度的目標(biāo)（需要更多的樣品量），難以檢測(cè)重復(fù)序列；也無法捕捉到目的基因表達(dá)水平的微小變化-而這恰恰是研究在刺激下或環(huán)境變化時(shí)的生物反應(yīng)所必需的。與芯片技術(shù)相比，基于測(cè)序的高靈敏SOLiD技術(shù)可對(duì)單個(gè)細(xì)胞和癌癥樣品中存在的痕量RNA進(jìn)行整體的全基因組表達(dá)圖譜分析，每次運(yùn)行能定位高達(dá)2億4千萬個(gè)標(biāo)簽（mRNA的相對(duì)表達(dá)水平可通過系統(tǒng)產(chǎn)生的序列標(biāo)簽數(shù)目來計(jì)算），可檢測(cè)低至每個(gè)細(xì)胞中10-40pg的總RNA

16、，即使mRNA表達(dá)水平很低，SOLiD系統(tǒng)也能夠無偏向性地分析樣品中存在的已知和未知mRNA，從而定量特定mRNA的差異表達(dá)模式。起始樣品比微陣列技術(shù)要少得多，尤其適用于來源極為有限的生物樣品分析，如癌癥干細(xì)胞-分析其基因和非編碼RNA的表達(dá)圖譜有助于有助于加速發(fā)掘潛在的生物標(biāo)志物，從而更準(zhǔn)確區(qū)分不同的疾病類型以及識(shí)別疾病易感性，幫助于研究人員更好地了解病變細(xì)胞的特性。更多RNA研究除了單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜分析，SOLiD系統(tǒng)在RNA方面的其他應(yīng)用還包括利用SOLiD Small RNA Expression Kit來發(fā)現(xiàn)和篩選小分子RNA，實(shí)現(xiàn)在無需預(yù)先知道序列信息的情況下高通量發(fā)現(xiàn)新的RNA

17、分子。這個(gè)方案有望顯著地提高研究人員鑒別小分子RNA的能力，將過去不可能完成的實(shí)驗(yàn)變?yōu)榭赡?。目前已發(fā)現(xiàn)的microRNAs還非常有限，SOLiD可在不知道目標(biāo)分子DNA序列的情況下進(jìn)行檢測(cè)和定量小的RNA分子，可將樣品制備工作從常規(guī)方法的四天縮短為僅需一天，是分析在生物樣品中表達(dá)的已知和未知miRNA及其它小分子RNAs的有效工具。利用SOLiD Whole Transcriptome Kit還可以探索和鑒定全轉(zhuǎn)錄本。SOLiD無可比擬的高通量和測(cè)序數(shù)據(jù)的高精確性使得可以用短序列讀長即可測(cè)序整個(gè)轉(zhuǎn)錄組。了解轉(zhuǎn)錄組對(duì)有助于解開導(dǎo)致復(fù)雜疾病的分子通路的秘密。這一系列應(yīng)用補(bǔ)充使研究人員能在單個(gè)超高通

18、量平臺(tái)上開展綜合的RNA研究。SNP分析盡管絕大多數(shù)的人類遺傳信息在所有人中都相同，但是研究人員通常更感興趣的是研究個(gè)體之間微小的遺傳差異。這種差異包括單堿基變異，以及被稱為結(jié)構(gòu)變異的各種較大片段DNA序列變異。結(jié)構(gòu)變異包括DNA片段的插入、缺失、倒位和易位，結(jié)構(gòu)變異的DNA片段范圍可從幾個(gè)堿基對(duì)到數(shù)百萬個(gè)堿基對(duì)，可能對(duì)基因產(chǎn)生重要影響，并導(dǎo)致人類疾病的發(fā)生。SOLiD流程獲得的嚴(yán)密的片段范圍，使研究人員可以鑒別出很寬范圍內(nèi)的插入和缺失片段，結(jié)構(gòu)重排也能很容易鑒別出來。這個(gè)平臺(tái)的超高通量使研究人員可輕而易舉地獲得高度基因組覆蓋率的數(shù)據(jù)，精確鑒定個(gè)體基因組中存在的數(shù)百萬個(gè)單堿基多態(tài)性SNP，揭示大量此前未知、具有潛在醫(yī)學(xué)價(jià)值的遺傳變異，從而