淺談怎么切好冰凍切片(轉(zhuǎn)載自丁香園)

1、【轉(zhuǎn)帖】冰凍切片技術(shù)介紹、制片技巧 冰凍包埋組織固定 冰凍切片免疫組化操作各類組織實際操作技巧（連載補充） 精華切片技術(shù)最早期是從冰凍切片開始，后來逐步有了發(fā)展和更新，冰凍切片彌補了石蠟切片和火棉膠切片之不足，石蠟切片和火棉膠切片需時太久，且在制片中要使用許多化學試劑，石蠟切片還需要加溫過程，因而某些重要的不穩(wěn)定的組織成分如脂類、酶以及抗體等，可能被溶解和破壞。冰凍切片過程較簡單，無須經(jīng)過上述步驟，組織中的水分起著包埋劑的作用，組織經(jīng)固定或不固定即可進行冰凍切片，切片厚度一般可在6-8微米，組織沒有收縮，易保持生活時原有狀態(tài)，是保存脂肪組織，許多神經(jīng)組織特殊染色方法和組織化學方法，特別是酶的活

2、性十分理想的切片方法，對于外科臨床診斷和現(xiàn)代免疫熒光診斷，冰凍切片也很重要。其缺點是組織過大不易冰凍，連續(xù)切片困難。5微米以下切片不易成功。但是隨著現(xiàn)在冰凍包埋液的不斷改進，已經(jīng)能切出少于3微米的切片一、直接冰凍切片法冰凍切片多用于新鮮組織、甲醛固定組織和冰箱冷藏組織等。組織塊不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺上冷卻后再進行切片。1恒冷箱切片就是將組織在恒冷箱的切片機切片。目前恒冷箱切片機的品種較多。此種切片適用于科研和教學上的連續(xù)切片。要求預先開動電源（預冷準備），配多種固定組織臺，以便更換組織。2甲醇制冷器制冷箱為附有帶導管的制冷臺和制冷刀的甲醇循環(huán)裝制，其冷卻速度比較快，屬于開放式，作一般常

3、規(guī)冰凍切片用。3二氧化碳冰凍法將組織用蒸餾水洗后，放在冰凍切片機的冷凍臺上，加蒸餾水少許。打開冷凍臺的二氧化碳開關(guān)，二氧化碳氣體噴出，待組織出現(xiàn)冷霜時，將二氧化碳關(guān)閉，即可切片。若組織冷凍過硬則切片易碎；組織冷凍硬度不足，則切片呈粥糜狀，需用間歇方法繼續(xù)冷卻。硬度一般在剛開始解凍時最合適，應(yīng)迅速切片。4半導體致冷冰凍切片法將組織置半導體致冷臺上，滴加少許蒸餾水，調(diào)好切片機的厚度。先接通熱器的循環(huán)流水，然后接通電源，電源的正負極切勿接反，用整流電源控制溫度。二、明膠冰凍切片法明膠包埋法一般多用于冰凍切片易破碎的組織，特別是某些有樹枝狀突起的組織，當其切片后投入水中時，常常引起分散，甚至發(fā)生丟失，

4、某些間隙較多的組織，有時會因發(fā)生散亂而失去相互間的聯(lián)系，可形成移位現(xiàn)象。明膠冰凍切片正是適用于上述情況。環(huán)保組織固定液固定后必須充分水洗，洗凈。因甲醛對明膠有凝固作用，從而影響明膠溶液浸入組織內(nèi)部,不宜選用含甲醛類固定液。組織水洗后浸入12.5%明膠水溶液(以1%石碳酸水溶液配制)，于37溫箱浸6-24h。移至25%明膠溶液內(nèi)浸6-24h。25%明膠包埋，連同包埋器放入冰箱內(nèi)使明膠迅速凝固，取出后在空氣中蒸發(fā)10min 。入環(huán)保組織固定液固定明膠塊1-2日。蒸餾水洗后，置冰凍切片機或滑動式切片機切片。切片可保存于10%甲醛液中。依檢查目的而進行染色，染色后一般不經(jīng)乙醇脫水及二甲苯透明，而用下述

5、明膠溶液或其他類似的明膠溶液封片：果糖26g,明膠1.1g，鉀礬0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。先將果糖溶于麝香草酚飽和液，置于56溫箱內(nèi)12h，加明膠后在水浴內(nèi)加溫熔化，過濾后加鉀礬。于100ml溶液內(nèi)加甲醛2ml防腐。三、冰凍切片粘片法1蛋白甘油粘片法冰凍切片粘片法基本上按石蠟切片的粘片處理，但烘烤的溫度不超過40。待烤干后立即取出，時間過久或溫度過高則切片易破碎?？靖珊笥?0%乙醇及蒸餾水洗后即可染色。2Lillie明膠粘片法將切片放入1%明膠水溶液數(shù)分鐘，撈出置于載玻片上，將多余液體傾去。入環(huán)保組織固定液中固定5min,水洗10min，即可染色。3乙醇明膠粘片法切片浸入0.1%

6、或0.75%明膠溶液（以40%乙醇配制）數(shù)分鐘，撈于載片上，經(jīng)室溫短時干燥，入氯仿1min ,經(jīng)95%及70%乙醇洗去氯仿，再經(jīng)蒸餾水洗后染色。四、冰凍包埋液包埋切片 OCT Compound 法現(xiàn)在國內(nèi)外有許多廠家用高分子材料配制成冰凍切片包埋液，將冰凍包埋液直接可直接在切片機組織卡盤（chuck）上加少許包埋液，在其固化前嵌入組織塊，然后再于組織周圍加入少許包埋液穩(wěn)定。常規(guī)切片，厚度2-100微米?；蛘咴谑吮镜陌衲＞邇?nèi)，擠出適量冰凍包埋液，放入組織塊或細胞沉淀塊，加包埋劑完全淹沒組織塊，如有氣泡可用針頭或吸頭吸出。速凍：將盛有組織細胞和包埋液的模具，正置于切片機冷室內(nèi)冰凍10分鐘，至包

7、埋液固化。也可將盛有組織的模具置于液氮或-40-70度冰箱冰凍固化保存，用前取出置于切片機冷室內(nèi)平衡溫度（否則損壞刀片）。冰凍包埋液是由高分子聚合物組成的透明粘稠液體，速冷時固化，其冰凍速度和軟硬韌度與組織細胞相近，因此能保證最佳O.C.T.，并具有支持填充、減少皺褶和斷裂的作用。能切出2-3微米的超薄切片。國內(nèi)較好的品牌有西奈山冰凍包埋液。冰凍切片組織塊的準備1.調(diào)整好組織與刀片的方向這是冰凍切片準備中極為重要的方面，使用冰凍切片組織包埋液可以使這項工作變得簡單，在我的工作中我總結(jié)出一些經(jīng)驗可供參考。a.脂肪放在最后切。脂肪由于硬度不夠，對絕大多數(shù)組織均合適的溫度卻切不好脂肪組織，如果一刀下

8、去，組織中的脂肪先接觸刀片，就會破碎并使整個片子損壞。如果脂肪最后接觸刀片，則切片過程不受干擾。最糟糕的情況是脂肪部分先接觸刀片而沒有冰凍切片包埋液（如西奈山品牌）的保護，冰凍包埋液可以給片子提供一個起始的緩沖，如果沒有包埋，脂肪就會切碎并把整個片子破壞。當切片過程中由于脂肪的出現(xiàn)而影響質(zhì)量時，我要么把搖柄轉(zhuǎn)回去盡量避免，要么把脂肪挖出來。b.組織與刀片垂直或成角是關(guān)鍵。讓我們假設(shè)組織由起始端、中間部分及末尾端三部分構(gòu)成，起始端容易卷縮，或受到刷子的損害，還可能由于操作者的猶豫而引起片子的厚薄不均，這些都增加了假象的風險。末尾端在貼片時容易拉長，最好的是中間部分，最不可能出現(xiàn)假象，并且組織學上

9、最干凈，這是片子中最理想的部分。非常堅實的組織容易產(chǎn)生橫皺，切片時應(yīng)包埋成角且盡可能的加溫。成角包埋就像坐著船沖浪一樣，如果你直線行駛，就會承受波浪線上最大的沖擊，如果成角行駛，波浪線就會拉伸，所受的顛簸也會減小。跟公路上的減速脊一樣的原理。上皮和粘膜貼附的組織如皮膚，胃腸，膀胱，子宮，頸部等，應(yīng)當使上皮面垂直于刀片（見下圖）。2.組織塊的溫度任何組織都有一個理想的切片溫度，在此溫度下切片，組織片以平滑均一的形式流過刀片，幾乎沒有卷縮。當溫度、組織類型、刀片均處于理想狀態(tài)時，切片十分流暢，幾乎不用刷子。如果溫度太低，片子容易卷曲和破碎；如果溫度太高，片子就會皺成一堆。如果需要加溫，只需要把大拇

10、指置于組織塊面幾秒鐘；如果需要降溫，可以使用機子的精確低溫包埋系統(tǒng)，簡單的做法就是把過凍的凍臺放在組織面上幾秒鐘，大多數(shù)的冰凍切片機都有一種熱吸收器可以使用。3.組織塊的填涂基本的修復填涂可以解決組織塊自身的缺陷，下面我舉幾個具體的例子。(1)扁平包埋組織的填涂包埋扁平的組織時，只有一層薄薄的包埋物貼附在底面，而且包埋物會輕微地收縮與組織塊分離，如果想以最小的休整開始切片，那么收縮的空間必須填涂上包埋物，如果不填涂，切片時組織便會與包埋物分離，從而很難獲得一張完整的片子。下面這個簡單的技巧可以使你獲得一個整齊的組織面。(2) 針頭的移除在工作中經(jīng)常會收到布滿針頭的標本，有時候針頭會穿

11、過整個組織，導致刀片的損壞并使片子一分為二，下面有一種簡單的解決辦法。接到標本后快速冰凍。2、切片厚度67微米。3、切片完整，無污染，無皺褶。4、切片完成后立即固定。5、染液，脫水液必須及時更換。6、封固前必須經(jīng)酒精脫水，環(huán)保組織液透明，濕封。7、封片時不得有氣泡，不得有樹膠外溢。8、標簽必須貼于玻片左側(cè)，編號字跡必須清楚。9、制片工作一般應(yīng)在1520分鐘內(nèi)完成。10、冰凍報告后及時將“冰對”組織放入環(huán)保組織固定液內(nèi)。11、每天操作完成后，及時對機器進行清理和消毒。（3）縫線的移除同樣的方法移除組織塊中的縫合線（4）挖鑿的技術(shù)當組織塊中某些部分不需要或阻礙我們獲得高質(zhì)量的切片時，我們就可以將它

12、挖除掉。最好的例子就是脂肪組織干擾切片，常見于切除的淋巴瘤用于檢查是否癌轉(zhuǎn)移。如果脂肪先于組織塊中的其他部分接觸刀片，你首先可以試著轉(zhuǎn)動組織塊，如果不行，就可以將它挖掉，然后用冰凍包埋液填充。學會看片子這里指的是片子滑過刀片時就要辨別出質(zhì)量的好壞，如果到鏡下才發(fā)現(xiàn)片子的缺陷那就無法挽救。1.觀察片子的厚薄盡管冰凍切片機可以設(shè)置厚度，但人為辨別片子的厚度是否合適仍然很重要。片子太薄看起來象半透明的鏡紙，片子太厚看起來混濁、柔性差，對我來說，5-6um的片子較合適，象一張薄的打印紙。3.片子上的條紋垂直于刀片的細條紋為刀片缺口所致，這往往是切到鈣化組織、針頭或縫線的結(jié)果。4.波浪線樣的橫皺這是切片

13、機零件松動的征象，可能需要修理，切片時刀片有移動或支撐刀片的機子有移動時，往往有這種規(guī)則的條紋出現(xiàn)。為了獲得干凈整齊的片子，所有固定刀片、刀架、支撐臺、支撐栓子及切片機的旋鈕、螺釘、軸承都必須上緊，并且不帶有垃圾殘骸，支撐臺或刀片下面有一點包埋物都會影響切片的質(zhì)量。脂肪組織的處理脂肪組織無疑是冰凍切片者的絆腳石，道理很簡單脂肪不會結(jié)冰，把溫度降低讓脂肪變硬可以切出較薄的片子，但是這個溫度對同一組織中的其他成分來說顯得太低而不合適切片，當脂肪破碎影響切片時這個問題就變得明顯，下面是一些我的經(jīng)驗總結(jié)。1.盡可能的削掉不需要的脂肪組織當我準備切淋巴結(jié)時，我會先檢查一遍，小心翼翼地除掉表面及髓內(nèi)的脂肪

14、，結(jié)內(nèi)的脂肪用解剖刀刮擦掉，被膜線附近的脂肪用刀切除，這樣就不需要切開整個淋巴結(jié)被膜。有人會說，我把一些組織去掉后，可能導致漏判一些陽性的淋巴結(jié)，但我的經(jīng)驗是好的干凈的片子比含有太多脂肪的差片子更容易獲得陽性的結(jié)果。當你在休整組織或切片的過程中脂肪組織意外出現(xiàn)時，你也可以使用前面的挖鑿技術(shù)。2.調(diào)整組織塊的方向使脂肪最后接觸刀片切片時盡量避免脂肪先接觸刀片，因為脂肪會脫離包埋物，在切片上留下一個洞，如果不能避免，也要在其周圍加上包埋物，讓包埋物先接觸刀片。3.保證刀片、臺面的干凈及組織塊的冷凍程度切片機的臺面和刀片必須保持干凈，假如你弄碎了一張片子必須即時用一塊干紗布清理干凈，但要防止刀片割手

15、，如果你發(fā)現(xiàn)切出來的片子有條紋或者堆積成束，可能是組織粘著在刀片的下方了，必須除掉刀片上的組織，并將刀片清理干凈。組織塊越冷就越容易切脂肪，只是其他非脂肪組織就變得堅硬難切，同時水性的組織會裂開，這就有必要在切片溫度的最冷端和最溫端取一個二者兼顧的中間值，以使脂肪和非脂肪組織都能切好。我一般將組織塊凍在-24度，可以獲得滿意的結(jié)果，冷凍噴霧劑有用，但要注意先清掉切片機內(nèi)的污穢。4.靈活地轉(zhuǎn)動搖柄而不猶豫假如組織塊是脂肪和結(jié)締組織的混合物，那要好切于純脂肪組織，有時候按照我前面所講的技巧來做，片子會出乎意料的好。用運動的刷子快速粘住組織片并把它拖上臺面，不要把刷子和組織片壓上臺面，以免粘在一起使

16、切片完全中斷。同樣，好的刀片也很重要，如果你能用刷子敏捷地做出這套動作，那你肯定也能對脂肪組織切出理想的片子，脂肪在片子上會留下空的間隙，但它們之間的纖維條卻保存完好。下面這塊乳腺癌及其周圍有數(shù)毫米覆蓋著墨水的脂肪組織，假如你調(diào)整好組織塊的方向使脂肪邊緣垂直于刀片，腫瘤組織就切得好，脂肪切片的角度會有變動，也會留下空隙，但總有一條墨跡線指示著邊緣的所在。很多時候我都用這種方法來區(qū)別腫瘤和脂肪組織。冰凍切片的基本技術(shù)1.從鋒利的刀片開始我發(fā)現(xiàn)使用新的鋒利的刀片時常常做出高質(zhì)量的片子。我覺得在醫(yī)療場合中某些盡量省錢的做法顯得有些因小失大。一般我對每位患者的標本都使用一組新的刀片，當片子的質(zhì)量開始下

17、降時，我會立刻更換刀片。某些組織如質(zhì)地較硬的膠原和鈣化組織會使刀片很快變鈍，因此，經(jīng)常更換刀片顯得很有必要，有時候我在切片過程中要連續(xù)更換2-3次刀片。2.坐著還是站著我切片時總是坐在一張凳子上。要學會把刷子作為一種便捷的輔助工具來操作，從而精細地控制顯微厚薄程度的片子。切片時俯身彎腰，頸部過伸的姿勢有些不妥，要盡量處于放松和舒適的姿勢以便能最大程度控制你的左手。3.刷子我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先學會使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到臺子上。冷凍的片子會自發(fā)的卷縮并從刷子上脫離下來，因此，我使用一把有硬毛、夾取面寬的刷子。我發(fā)現(xiàn)來自中國的野豬毛十分堅硬，非常管用。

18、你可以花3美元從工藝店買一把1/4英寸長的#2號扁平無色的刷子，把毛削成一個角度。由于是個有角的頭端，加上握持刷子成一定的角度，這樣刷子與組織接觸時就會象掃帚一樣的平。我不能理解為什么有人使用脆弱的駱駝毛刷子，組織片很容易從這些柔軟的毛上掉下來。4.握持刷子左手象拿筆一樣握持刷子，將第五指輕壓于臺面上以穩(wěn)定握筆的手(或根據(jù)手和切片機尺寸的大小置于你感覺合適的地方)，這樣可以保證操作者動作的靈活及可控性。我把刷子削成一個角度，大致與左手握持刷子的角度相同，這樣使刷子平著接觸組織的1/4。5.搖柄的旋轉(zhuǎn)以連續(xù)均勻的力量轉(zhuǎn)動切片機的搖柄，且要毫不猶豫。我看到很多冰凍切片者手握著刷子在開始切片時總要停

19、一下，緩慢的抓取組織，然后再開始轉(zhuǎn)動搖柄。依我的經(jīng)驗看來，這種動作增加了起始切片假象的可能，會使片子的厚度不均勻，也增加了處理脂肪類組織的難度。我切片時，象前面所說的那樣手握刷子，以一種連續(xù)的動作抓取組織，這個動作與刀片接觸組織同時開始并貫穿于整個過程。6.刷子的移動組織塊移向刀片時刷子也要同步地向下移動，當組織塊剛好接觸刀片時刷子輕輕停在其底部2mm處并迅速抽離。正是刷子的向下移動使你能連續(xù)地抓取組織，當開始的幾毫米組織穿過刀片時便有自發(fā)卷曲的現(xiàn)象，這時，運動中的刷子立刻粘住其游離的邊緣部分并水平地拖向切片者。刷子的運動路徑是一個朝下的“肘”形，然后再朝向你自己，連續(xù)不斷。但要注意有時候把組

20、織壓向臺面時會使組織粘在臺面上，可能會導致碎片，應(yīng)盡量避免。當然預先將組織包埋起來可以使刷子不用接觸到組織，切片也容易多了。7.貼片可以從切片機的臺面上也可直接從組織塊面粘貼組織片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一個角度粘住片子的一角，在靜電作用下片子會吸附在玻片上并迅速融化。當然在周圍涂一些包埋物對貼片有利，這種多余的包埋物可以保護片子的邊緣免受皺縮的損壞。有時候碰到貼片困難，我會在切到最后2mm包埋物的時候停下來，讓片子留在組織塊上，然后倒轉(zhuǎn)搖柄，使組織塊退離刀片，再用刷子從邊緣把組織片攤平，這樣就可以從組織塊面貼片了，這對卷曲的片子或者脂肪組織非常管用。8.快速固

21、定我右手轉(zhuǎn)動搖柄也同時拿著玻片，片子一切好，立刻粘起片子并將它浸沒于環(huán)保固定液中。環(huán)保固定液需置于方便夠到的地方，我一般將染色架放在染色缸的旁邊，先將片子置于環(huán)保固定液液中固定，然后插于染色架上。如果組織固定延遲會出現(xiàn)風干的假象，我的經(jīng)驗是組織片還在切片機的臺面時，風干效應(yīng)很小，當組織片粘在有溫度的玻片上時就會出現(xiàn)明顯的風干假象，表現(xiàn)為核的細節(jié)丟失及胞漿液的溢出。下面幾張圖片是延遲15秒固定和立刻固定的相同組織的比較，差異非常明顯9.切片的厚度對于一般的手術(shù)病理我推薦切6um厚，這種厚度使染色更加飽滿，層次清晰，病理學家通常在2x 和 4x的放大倍數(shù)下可以獲得更多的信息。太薄的片子在這種放大倍

22、數(shù)下顯得蒼白，容易忽略一些細節(jié)。6um的片子可以有更多的時間去避免風干假象，也會減少冰晶所造成的細胞核空洞。當然特殊情況下可能需要更厚或更薄的片子。10.為什么會掉片我不能確定組織片粘附到玻片的具體機制，但我相信可能與組織內(nèi)的液體與玻片發(fā)生分子交聯(lián)有關(guān)。下面我例出幾種染色過程中組織片脫落的情況：1）本身非常干燥或過度脫水的組織；2）組織片的周長與面積比過大，象細條形的組織容易受染色缸內(nèi)液體渦旋應(yīng)力的影響而脫落，同樣包括薄的纖維囊腫及不規(guī)則的壞死組織，太厚的組織也不例外；3）反藍用的氨水濃度太高；4）少數(shù)情況需要使用100%的乙醇固定；5）一張玻片貼多個片子時，片子周圍的包埋物相互重疊冰凍切片的

23、局限1.時間的限制確實在冰凍切片室經(jīng)常受到快速出結(jié)果的壓力，我的經(jīng)驗是欲速則不達，急躁和慌亂容易出錯。我們最好的辦法就是樹立自信，良好的態(tài)度及教育外科醫(yī)生，受到加快制片的催促時應(yīng)當學會從各方面抵制壓力，假如你是一位專業(yè)的受過良好訓練的冰凍切片家，從切片到染出一張片子只需要幾分鐘，如果你對組織的處理很粗糙，這個過程可能要幾分鐘到十分鐘，碰到比較大的復雜的組織需要多重染色則需要的時間會更多，對病理學家來說，閱片需要幾秒到數(shù)十秒的時間，有時候需要搜尋一些細小的線索，翻閱書籍，或向同行咨詢等，所需時間會更多?？紤]到外科醫(yī)生的處境，我們必須動作迅速，但是當所做的結(jié)論會更改手術(shù)的進程時，我們會顯得格外謹慎。我們會要求提供患者的詳細資料以便得到正確的答案，即使耽誤幾分鐘，總比重做手術(shù)或提供錯誤的結(jié)論所付出的代價小