臨床免疫實驗2

1、醫(yī)學免疫學醫(yī)學免疫學實驗二實驗二實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容一、淋巴細胞轉化實驗（操作一）一、淋巴細胞轉化實驗（操作一）MTT法法二、酶聯(lián)免疫吸附試驗（操作一）二、酶聯(lián)免疫吸附試驗（操作一） ELISA（雙夾心法）法檢測乙肝表面（雙夾心法）法檢測乙肝表面抗原（抗原（HBsAg） 一、淋巴細胞轉化實驗一、淋巴細胞轉化實驗（ MTT法操作一）法操作一）n原理原理n方法方法n結果結果n應用應用MTT法法四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法 原理：原理：T淋巴細胞在有絲分裂原刺激下，發(fā)淋巴細胞在有絲分裂原刺激下，發(fā)生有絲分裂，形成淋巴母細胞。其蛋白質合成生有絲分裂，形成淋巴母細胞。其蛋白質

2、合成與與DNA合成及代謝比正常細胞旺盛，活細胞線合成及代謝比正常細胞旺盛，活細胞線粒體中某些酶可將粒體中某些酶可將MTT還原為藍黑色甲臜用還原為藍黑色甲臜用溶解甲臜，在溶解甲臜，在nm處測值，處測值，能夠反映淋巴細胞的增殖轉化程度能夠反映淋巴細胞的增殖轉化程度MTT法值對照管值刺激管ODODConASI MTT-四甲基偶氮唑鹽絲裂原絲裂原MouseHumanTBTBConA+-PHA+-+-PWN+/-LPS-+-SpA-+實驗步驟實驗步驟無菌取1/2的脾研磨成單細胞懸液細胞計數(shù)(40)96孔培養(yǎng)加板(三復孔)調(diào)細胞濃度1107/ml5%CO2 37培養(yǎng)44小時加入加入MTT (5mg/ml)

3、 10ul/well5% CO2 37 繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)4小時小時輕輕吸去上清，輕輕吸去上清，加加DMSO，溶解甲臜顆粒，溶解甲臜顆粒A570nmELISA plate reader 實驗組加入不同濃度ConADay 1Day 3注意事項注意事項:n由于本實驗需要培養(yǎng)由于本實驗需要培養(yǎng)3天，才能觀察結果。天，才能觀察結果。因此，在操作時應注意無菌操作，避免因此，在操作時應注意無菌操作，避免細菌污染，導致實驗的失敗。細菌污染，導致實驗的失敗。實驗步驟：實驗步驟：(本次課完成本次課完成)n1、制備脾細胞懸液、制備脾細胞懸液n1）取脾）取脾：用用1000ul加樣器加樣器取取5ml 培養(yǎng)液放入平皿中培

4、養(yǎng)液放入平皿中.頸部脫頸部脫臼處死小鼠，酒精消毒，無菌取脾臟，用毛玻璃片磨碎，放在臼處死小鼠，酒精消毒，無菌取脾臟，用毛玻璃片磨碎，放在平皿中，隔著紗布吸出細胞懸液放入離心管中，離心平皿中，隔著紗布吸出細胞懸液放入離心管中，離心1500r/min,20min。棄去上清。棄去上清,加入加入3mlIMDM培養(yǎng)液，混勻。培養(yǎng)液，混勻。n2）細胞計數(shù)：）細胞計數(shù)： 取取0.2ml 放入一試管中放入一試管中, 加入加入1.8ml細胞計數(shù)液。細胞計數(shù)液。取取20m ml填充細胞計數(shù)板填充細胞計數(shù)板, 顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)方法顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)方法。n 3）調(diào)細胞濃度到）調(diào)細胞濃度到510/ml ：如配制如配

5、制10mL稀釋細胞懸液稀釋細胞懸液:從細胞懸液中取從細胞懸液中取(2000/X)mL至試管至試管, 加入培養(yǎng)液至加入培養(yǎng)液至10 ml即即可?？伞＜毎嫈?shù)方法細胞計數(shù)方法l 查出四個16個大方格的總細胞數(shù)(X)l 算出每個大方格的細胞數(shù)：Y=X4l 每個大方格的體積為V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4mll 制備的細胞懸液的細胞濃度（A/ml)=Y 104稀釋倍數(shù)(10)4實驗步驟（本次課完成）實驗步驟（本次課完成）2、加、加 板板n每孔加入每孔加入100m ml的調(diào)好的細胞懸液的調(diào)好的細胞懸液n1-3孔孔(對照對照)加入加入10%FCS-IMDM 100m ml n4-6孔加

6、入孔加入20m mg/ml的的ConA 100m mln7-9孔加入孔加入10m mg/ml的的ConA 100m mln10-12孔加入孔加入5m mg/ml的的ConA 100m mln3、細胞培養(yǎng)：、細胞培養(yǎng)：5% CO2 孵箱內(nèi)孵箱內(nèi)37培養(yǎng)培養(yǎng)48h。n4、MTT摻入摻入：在終止培養(yǎng)前：在終止培養(yǎng)前4小時（培養(yǎng)小時（培養(yǎng)44小時）加入小時）加入MTT (5mg/ml)10m ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，至孔，繼續(xù)培養(yǎng)，至48小時終止培小時終止培養(yǎng)養(yǎng)(此步驟由實驗小組長完成此步驟由實驗小組長完成 )。實驗步驟：實驗步驟：(下次課完成下次課完成)n5、結果測定：、結果測定：棄上清，加入棄上清，加

7、入DMSO (100m ml/孔孔)，振，振蕩溶解甲蕩溶解甲臢顆粒。臢顆粒。充分溶解后用酶標儀測定其吸光度充分溶解后用酶標儀測定其吸光度值。值。OD570nm。100%未轉化的淋巴細胞數(shù)轉化的淋巴細胞數(shù)轉化的淋巴細胞數(shù)轉化率形態(tài)學n淋巴母細胞在形態(tài)學上的表現(xiàn)主要有體積明顯增大，是成熟淋巴淋巴母細胞在形態(tài)學上的表現(xiàn)主要有體積明顯增大，是成熟淋巴細胞的細胞的34倍；染色質疏松，核仁清晰可見；胞漿豐富并形成空倍；染色質疏松，核仁清晰可見；胞漿豐富并形成空泡。泡。n根據(jù)細胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結構以及根據(jù)細胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結構以及有無核仁等特征，分別計數(shù)淋

8、巴母細胞、過渡型母細胞和核絲分有無核仁等特征，分別計數(shù)淋巴母細胞、過渡型母細胞和核絲分裂相細胞以及成熟的小淋巴細胞，以前三者為轉化細胞，每份標裂相細胞以及成熟的小淋巴細胞，以前三者為轉化細胞，每份標本計數(shù)本計數(shù)200個細胞，按下式計算轉化率：個細胞，按下式計算轉化率： 淋巴細胞轉化實驗的應用淋巴細胞轉化實驗的應用n檢查患者細胞免疫功能檢查患者細胞免疫功能n估計疾病的療效及預后估計疾病的療效及預后n細胞配型抗原的檢查：移植免疫細胞配型抗原的檢查：移植免疫MLRn免疫藥理學：具有免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品、中草藥免疫藥理學：具有免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品、中草藥及生物制品及生物制品n衛(wèi)生毒理學的研究衛(wèi)生毒

9、理學的研究二、二、ELISA（雙夾心法）法（雙夾心法）法檢測乙肝表面抗原（檢測乙肝表面抗原（HBsAg） 【目的】【目的】1.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理。掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理。2.熟悉熟悉ELISA的基本類型和用途。的基本類型和用途。3.掌握用酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗夾心法檢測掌握用酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗夾心法檢測乙型肝炎表面抗原的方法。乙型肝炎表面抗原的方法。【實驗原理】【實驗原理】n先將已知抗體包被在固相上，洗去未吸附的抗先將已知抗體包被在固相上，洗去未吸附的抗體；加入待檢標本，充分作用后，標本中相應體；加入待檢標本，充分作用后，標本中相應的抗原與固相上已知抗體結合，洗去未結合的的抗原與固

10、相上已知抗體結合，洗去未結合的抗原成分；加入已知的酶標抗體，再洗去未結抗原成分；加入已知的酶標抗體，再洗去未結合的酶標抗體；加底物后，酶分解底物產(chǎn)生呈合的酶標抗體；加底物后，酶分解底物產(chǎn)生呈色反應，根據(jù)顏色的深淺判定待檢標本中抗原色反應，根據(jù)顏色的深淺判定待檢標本中抗原的量。的量。固相載體n最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性來的免疫學活性 。Enzymen常用的酶常用的酶n辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(horseradish perox

11、idase, HRP)。n堿性磷酸酶堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)。n葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶半乳糖苷酶和脲酶等。等。 HRP的底物n 鄰苯二胺鄰苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)n四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine, TMB)OPDnOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是比色方便，是HRP結合物最常用的底物。結合物最常用的底物。nOPD本身難

12、溶于水，本身難溶于水，OPD2HCL為水溶性。為水溶性。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。nOPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色黃色 返回返回Application of ELISAn目前應用最廣泛的免疫學檢測技術之一，常用目前應用最廣泛的免疫學檢測技術之一，常用來檢測機體的可溶性的抗原或抗體。來檢測機體的可溶性的抗原或抗體。n敏感性高，可檢測微量的的抗體體或激素、細敏感性高，可檢測微量的的抗體體或激素、細胞因子及粘附分子等抗原性物質。胞因子及粘附分

13、子等抗原性物質。n成品的試劑盒，已廣泛用于某些臨床疾病的診成品的試劑盒，已廣泛用于某些臨床疾病的診斷。斷。返回返回常用的常用的ELISAELISA方法方法n直接法直接法 (n間接法間接法 (n夾心法夾心法 (直接法直接法間接法間接法夾心法夾心法n【材料與試劑】【材料與試劑】n1材料：材料：n酶標板（酶標板（96孔）、微量加樣器、酶標檢測儀、濕盒、水浴箱，孔）、微量加樣器、酶標檢測儀、濕盒、水浴箱，43培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱n2試劑：試劑：n1）包被抗體：抗）包被抗體：抗HBs(用包被緩沖液稀釋用包被緩沖液稀釋2ug/ml)n2）酶標抗體（）酶標抗體（HRP抗抗HBs,用洗滌液稀釋用洗滌液稀釋1:300）

14、n3）HbsAg表面抗原（乙肝疫苗表面抗原（乙肝疫苗,用樣本稀釋液稀釋用樣本稀釋液稀釋1600ng/ml即即1.6ug/ml）n4）模擬待檢樣品（）模擬待檢樣品（HBsAg疫苗疫苗,用樣本稀釋液稀釋用樣本稀釋液稀釋400ng/ml即即0.4ug/ml）n5）包被緩沖液）包被緩沖液pH9.6 0.05mol/L碳酸鹽緩沖液。碳酸鹽緩沖液。 n6）洗滌液）洗滌液 0.01M pH7.4 PBS 含含0.1% Tween20（不含任何防腐劑）。（不含任何防腐劑）。n7）封閉液）封閉液 ： 0.01mol/L、PH7.4PBS內(nèi)含內(nèi)含1% BSA,。n8）樣品稀釋液）樣品稀釋液 含含0.25% BSA

15、-洗滌液。洗滌液。n9）底物緩沖液（）底物緩沖液（pH5.0） 0.2M Na2HPO4 25.75ml+0.1M檸檬酸檸檬酸24.25ml+30% H2O2 100l。n10）底物溶液）底物溶液 鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)1mg/ml 溶于底物緩沖液中，臨用前配制。溶于底物緩沖液中，臨用前配制。n11）終止液）終止液 2mol/L H2SO4（22ml濃濃H2SO4+178ml dH2O）。）。n【實驗學時】【實驗學時】2.5學時，分兩次課完成。學時，分兩次課完成。n【實驗步驟】【實驗步驟】n第一次操作，用時第一次操作，用時25分鐘分鐘n1、抗體包被：、抗體包被：用包被液將抗用包被液將抗HB

16、s稀稀釋至適當濃度（釋至適當濃度（2ug/ml），酶標板），酶標板中中110孔每孔加孔每孔加100l，1112做做空白對照（不加樣）空白對照（不加樣）,將反應板移至溫將反應板移至溫盒內(nèi)，盒內(nèi)，4放置過夜（可保存一周，放置過夜（可保存一周，下次課后續(xù)操作）。下次課后續(xù)操作）。第二次操作，下次課完成，用時第二次操作，下次課完成，用時100分鐘分鐘n2、封閉：、封閉：棄去包被液，每孔加入棄去包被液，每孔加入200ul封閉液，封閉液，1112孔空白對照孔空白對照,置置43 溫箱溫箱20min。n3、洗滌：、洗滌：棄去包被板孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿棄去包被板孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿110孔，靜置孔，靜置13

17、min后后甩干，洗滌甩干，洗滌1次，于吸水紙上拍干。次，于吸水紙上拍干。n4、加樣：、加樣：1-2、4-8每孔加樣品稀釋液每孔加樣品稀釋液100l，3、4孔加孔加1.6ug/ml HbsAg表面抗原，表面抗原，100ul/孔，自第孔，自第4孔混勻后吸出孔混勻后吸出100ul加入第加入第5孔，以此孔，以此方法對倍稀釋至方法對倍稀釋至8孔孔,吸出吸出100ul棄之棄之,910孔加入待檢樣品孔加入待檢樣品100ul/孔孔,輕輕輕輕振動混勻置于振動混勻置于4320min，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次次，每次13分鐘分鐘,拍干。拍干。n5、加酶標抗體、加酶標抗體：每孔加：每孔加HRP抗抗HBs100l（空白孔不加），置于（空白孔不加），置于 4320min，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次次，每次1