大腸桿菌系統(tǒng)改造及琥珀酸和5

1、大腸桿菌系統(tǒng)改造及琥珀酸和 5- 氨基乙酰丙酸合成途徑的構(gòu)建進(jìn)入 21 世紀(jì), 隨著環(huán)境污染和石油資源的日益枯竭 ,可持續(xù)發(fā)展已經(jīng)深入人 心。而工業(yè)微生物作為可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要支撐 , 是解決資源危機(jī)、生態(tài)環(huán)境 危機(jī)以及改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵所在。目前, 工業(yè)微生物技術(shù)已經(jīng)滲透到包括醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、能源、化工、環(huán)保等幾 乎所有的工業(yè)領(lǐng)域 , 并扮演著越來越重要角色。而代謝工程已經(jīng)發(fā)展成為一種最 有力的優(yōu)化微生物代謝途徑、提高微生物目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)能力的工具。大腸桿菌作為一種研究最透徹的模式微生物具有無可比擬的優(yōu)越性： 遺傳背 景清晰、易操作、生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單等。因此 , 通過基因工程改造大腸桿 菌

2、發(fā)酵生產(chǎn)重要的工業(yè)產(chǎn)品 , 實(shí)現(xiàn)工業(yè)原材料來源的根本轉(zhuǎn)變具有重要意義。本研究首先在分析了大腸桿菌基因表達(dá)調(diào)控方式的基礎(chǔ)上 , 構(gòu)建了一種環(huán)境 壓力誘導(dǎo)型的表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)不依賴于人為誘導(dǎo)劑的添加 , 當(dāng)菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期后期 , 該系統(tǒng)被誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)錄下游基因。在分析該表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)后 , 我們成功將該系統(tǒng)應(yīng)用于聚羥基丁酸酯 (PHB) 的發(fā)酵生產(chǎn)中。發(fā)酵結(jié)果顯示工程菌株DHa (pQKZ103)在不添加任何誘導(dǎo)劑的條件下積累菌體干重、PHB濃度以及PHB含量分別為4.1 g/L、3.52 g/L和85.8 wt% 而對(duì)照菌株DH5x (pBHR68在添加O.lmMIPTG誘導(dǎo)后,菌體干重、PH

3、B濃度 及 PHB含量分別為 2.3 g/L,0.98g/L 和 42.6 wt%。顯然,本研究所構(gòu)建的環(huán)境壓力誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)明顯優(yōu)于IPTG誘導(dǎo)系統(tǒng)。在構(gòu)建了環(huán)境壓力誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)后 , 我們具體針對(duì)大腸桿菌葡萄糖中心代謝進(jìn)行 了分析。在大腸桿菌發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)重組蛋白以及化工原料時(shí) , 如何解決乙酸分泌問 題一直受到大家的關(guān)注。 大約 30%的葡萄糖流向了乙酸的生成 , 不僅造成了浪費(fèi) 同時(shí), 乙酸的積累對(duì)菌體的生長(zhǎng)造成了巨大的毒害。在系統(tǒng)分析葡萄糖代謝的基礎(chǔ)上 , 我們采用基因敲除的方法 , 對(duì)大腸桿菌中 乙酸相關(guān)基因 ptsG、poxB、pta 以及 iclR 進(jìn)行缺失 , 分析每個(gè)基因

4、對(duì)乙酸積累的 影響。最終構(gòu)建了乙酸分泌量大大減少的好氧發(fā)酵菌株QZ1110平臺(tái)。同時(shí),我們構(gòu)建了非編碼sRNA勺表達(dá)載體。在菌株QZ1110中過量表達(dá)RyhB sRNA分析RyhBsRNA寸葡萄糖代謝的影響(琥珀酸積累提高7倍)。培養(yǎng)結(jié)果初步證實(shí)了 sRNA乍為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的工具應(yīng)用于代謝工程的可行 性。隨后,我們通過敲除sdhA基因,構(gòu)建了琥珀酸好氧發(fā)酵途徑,QZ1111工程菌 株積累琥珀酸至 26.4 g/L 從氧化還原平衡的角度分析 , 琥珀酸相寸于葡萄糖具有 更高的氧化還原電勢(shì)，而PHB相對(duì)于葡萄糖具有更低的氧化還原電勢(shì)。因此，我們將PHB合成途徑引入琥珀酸好氧發(fā)酵菌株,成功構(gòu)建了發(fā)酵

5、葡萄 糖聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的工程菌株QZ1112培養(yǎng)結(jié)果顯示,聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB相比 琥珀酸單獨(dú)發(fā)酵具有更大的優(yōu)勢(shì) , 葡萄糖得到了更好的利用?；谏餆捴频乃枷?,我們構(gòu)建了同時(shí)利用甘油 (或葡萄糖)和脂肪酸聯(lián)產(chǎn)琥 珀酸和聚羥基脂肪酸酯(PHA)的工程菌株，這為利用生產(chǎn)生物柴油中產(chǎn)生的副產(chǎn) 物提供了一個(gè)選擇。在構(gòu)建琥珀酸發(fā)酵菌株的基礎(chǔ)上 , 我們將研究集中在與琥珀 酸相關(guān)的另一種重要的化合物： 5-氨基乙酰丙酸 (ALA)。過去,該氨基酸主要通過化學(xué)合成法合成。近年來，基于C4途徑的生物轉(zhuǎn)化 法吸引了眾多學(xué)者的關(guān)注和研究 ,即通過人為添加琥珀酸和甘氨酸繼而通過培養(yǎng) 的細(xì)胞一步催化生成 ALA

6、。而本研究則獨(dú)辟蹊徑,意在通過基于大腸桿菌 ALA C5合成途徑的改造,構(gòu)建 一株、以廉價(jià)無機(jī)鹽為培養(yǎng)基發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn) ALA的工程菌株。通過培養(yǎng)，我們證實(shí)hemA基因是C5合成途徑中第一個(gè)限速酶,同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)hemL也是C5途徑 中的關(guān)鍵酶。工程菌株DAL (hemAM, hemL積累ALA達(dá)到2.05 g/L。通過培養(yǎng)我們發(fā)現(xiàn) gltX基因的表達(dá)不利于ALA的積累，而熒光定量PCR證實(shí)gltX基因的表達(dá)不利 于ALA的積累的原因是由于gltX基因的表達(dá)上調(diào)了 hemB基因的表達(dá)。為了加速ALA的細(xì)胞外排，降低細(xì)胞內(nèi)ALA的濃度，我們分析了 ALA的胞外運(yùn) 輸相關(guān)蛋白并過量表達(dá) rhtA 基因 , 培養(yǎng)結(jié)果顯示 ,rhtA 的過量表達(dá)顯著提高了 ALA的產(chǎn)量(45.9%)。而通過發(fā)酵罐培養(yǎng),ALA的最大產(chǎn)量為4.13g/L。在大腸桿菌中,hemB基因編碼HemB崔化ALA生成膽色素原，因此，可控降解 Hem旳能有利于ALA的積累。我們通過在基因組上hemB基因的C端添加一段蛋 白質(zhì)降解標(biāo)簽 ssrA。在小分子蛋白SspB的協(xié)助下，加有ssrA降解標(biāo)簽的HemE蛋白可迅速被 ClpXP蛋白酶體降解，從而起到降解He