Western Blot 原理和操作方法(詳細(xì))

1、Western Blot 原理和操作方法（詳細(xì)）$5V  工作原理 Y|-_2IU  蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下,向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無(wú)電滲作用,樣品用量少(1-100g),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過(guò)調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用. -O?'Q%9v  SDS-P

2、AGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量. <+sQ  PAGE能有效的分離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異,因?yàn)镾DS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT),其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu),電泳樣品假如

3、樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時(shí),蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質(zhì)也完全變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子,這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其原來(lái)所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來(lái)所帶的電荷可以忽略不計(jì),消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小,這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基. TIZO4Jz  樣品處理液

4、中通常加入溴酚藍(lán)染料, 溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子,可以自由通過(guò)凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí),即可停止電泳. &$?> &A  另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部. T&ZpP_  重要參數(shù) (iLo=fd78  聚丙烯酰胺凝膠(PAG)制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C)決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個(gè)參數(shù).一般可以由下述公式計(jì)算: 2l# 6

5、60;T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100% &*xjs  其中: a=雙體(bis)的重量 ;b=單體(arc)的重量 ;m=溶液的體積(ml) uUo!kl H  L0#p36e  當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí),常常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗(yàn),以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度: RKB6&r5k  2OJxL"mEc  蛋白質(zhì)分子量范圍(Da) 適宜的凝膠濃度(%) rQ9+x6  <104 20-30 &quo

6、t;(pga  1×104-4×104 15-20 tuv7?0:F  4×104-1×105 10-15 y<qek)  1×105-5×105 5-10 V>wj "  >5×105 2-5 LpS)D: xN  _#28fOo  分離膠: N%< k4  電泳凝膠濃度 hR7z|dx*  試劑 10% 12% 15% 10% 12% 15% G9,r$E  H2O(ml) 4.0 3.3 2.3

7、5.9 4.9 3.4 zHVI2 w  30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.5 ngl88w  1.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.8 Dj'3*=5  10%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 5 HHU.kmp  10%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 t'9tNki  TEMED(l) 4 4 4 6 6 6 <TA.xIK9O

8、*  總體積(ml) 10 15 %1KSKC  AGVzr  濃縮膠 <KmN  試劑 濃度(5%) 8b$fn DT  H2O(ml) 4 2 1O3*'5 :z  30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.5 a#Jv$v  1.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.5 >z!bT*E<  10%SDS(l) 80 40 +3L4#  10%AP(l) 60 30 #)_*u!|  TEMED(l) 8 4 pj> Q.

9、  總體積(ml) 6 3 0d,F0,=v  ,#N*R"NP  蛋白質(zhì)的樣品制備： FqeRI$P  蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問(wèn)題： Fg8 q  1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。 5pQb8TH%  2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。 t n<ME'  3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。 r&am

10、p;k'>8  4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過(guò)程中的人為的修飾，制備過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑） SxPvLa  5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。 "iZm.<?  一：準(zhǔn)備工作： #W$oG?z  一個(gè)水浴箱，一臺(tái)超聲裝置，組織勻漿器 t> XQL  二：需要的溶液： cGKLdZ  裂解液 Laemmli樣品緩沖液 0TGJD$ 5|O  三：操作步驟： u:,"

11、;O|a7  1)培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備： Go-Wc2  1：胰酶酶解后裂解： /%+r"0uE  細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450l裂解液反復(fù)吹打。 i'2g_4" D  2：皿上直接裂解： X(tt?EiBW  細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450l裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。 8U/$Ce2  以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時(shí)為5S，間歇時(shí)間

12、為10S，功率為100-120W至溶液清澈無(wú)粘稠為止，處理過(guò)程在水浴中進(jìn)行，后425000g離心1小時(shí)取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月） QY  2)組織樣品的制備： cer.$VW  手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以

13、清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘?buffer中，混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍

14、存，-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。） =KDbWt  蛋白質(zhì)的樣品制備： Z(4UU  蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問(wèn)題： kDS1G r*  1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。 p.#w,0e&  2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。 K 7sRYkB  3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。 YlQEN43  4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理

15、過(guò)程中的人為的修飾，制備過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑） qtUc(  5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。 R'hT-3H  一：準(zhǔn)備工作： 3qAo-ll  一個(gè)水浴箱，一臺(tái)超聲裝置，組織勻漿器 lab#?q35  二：需要的溶液： ?tw %  裂解液 Laemmli樣品緩沖液 %sMghw  三：操作步驟： llK(4  1)培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備： !?SlZ3e2  1：胰酶酶解后裂

16、解： IdH8  細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450l裂解液反復(fù)吹打。 82#*.0c  2：皿上直接裂解： hM 1N-;  細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450l裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。 jkR!:R;&  以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時(shí)為5S，間歇時(shí)間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無(wú)粘稠為止，處理過(guò)程在水浴中進(jìn)行，后425000g離心1小時(shí)取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次，每

17、次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月） 1Y5C>t  2)組織樣品的制備： ng-"iC  手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入

18、相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘?buffer中，混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。） YV, QiTZ  #mLqr5  附： SKe2

19、x 0  一：裂解液的制備： vV|Yw1  組織裂解液（全細(xì)胞蛋提?。?：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4 !: 1< u|  2: Nacl 150 mmoL/L ;ON8.jRR K  3: 去氧膽酸鈉 0.25% :Xu$RR )B  4：NP-40或Triton-x-100 1% I:3OLs9N$  5: EDTA 1 mmoL/L >fL5  6： PMSF 1 mmoL/L goG:W  7： Aprotinin 1g/ml y CxV 6  8: leupe

20、ptin 1g/ml zkCJTa#pt  9: pepstain 1g/ml 79 f|k=  其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。 #Gl6  d"ajd<E  細(xì)胞裂解液：1：NP-40裂解體系：150 mmoL/L Nacl aUI;V1hs  1.0%NP-40或Triton-x-100 fFVF>j  50 mmoL/L Tris(PH8.0) IJquXhc  2：RIPA裂解體系：150 mmoL/L Nacl IOosZZ+5  1.0%NP-40或Triton-x-1

21、00 fh? 6+  0.5%脫氧膽酸鈉 (ca1 &B9V  0.1%SDS _&&)YBBP  50 mmoL/L Tris( ph8.0) r xbL  4z!%Pfoep  二：Laemmli 樣品緩沖液配置（1*SDS樣品緩沖液） bohC"EK  50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0） WTw8F  100 mmoL/L DTT BGDu.K  2% SDS ,nh?6  0.1% 溴酚藍(lán) 9v,hI ?G0  10% 甘油 qBq!o

22、V  此液可以配置成不同的儲(chǔ)存液，根據(jù)蛋白濃度而定，40C長(zhǎng)期保存，用時(shí)臨時(shí)與蛋白液按比例混合，其中DTT應(yīng)臨時(shí)加入，以防降解。 NBf8  蛋白質(zhì)定量 Vj/ 76Ab=  ,?WA.D  1)Bradford法: e0z.9SB  檢測(cè)原理: Bradford與蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu),特殊氨基酸結(jié)合,由棕色變成藍(lán)色,595nm檢測(cè).該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過(guò)0.2%影響測(cè)定結(jié)果,如TritonX-100,SDS,NP-40等. >n I$k5G  

23、Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml濃磷酸;然后,用蒸餾水補(bǔ)充至200ml;此染液放4至少6個(gè)月保持穩(wěn)定. ;_,(h5  標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的制備:盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品,例如測(cè)定抗體,可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn),如果待測(cè)樣品是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,通常在20g -150g/100l之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. e&6+r&  將待測(cè)樣本溶于100l緩沖溶液中,該緩沖溶液相同(最好用PBS) Xxn:nB  按照1:5用水稀釋濃燃料結(jié)合溶液,如果出現(xiàn)沉淀,過(guò)濾除

24、去. >(&%+qa  每個(gè)樣品家5ml稀釋的燃料結(jié)合溶液,作用5-30分鐘,燃料與蛋白結(jié)合,將由紅色變?yōu)樘m色,在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度,注意顯色反應(yīng)不超過(guò)30分鐘. c)H(< ?  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的濃度. _r-)jYu_  *dq!5ad  2)Lowry法: +ED 1 lS  檢測(cè)原理: 是Cu2+與蛋白作用生成的Cu+與雙縮脲試劑形成蘭色絡(luò)合物,菲林試劑增強(qiáng)蘭色形成,750nm檢測(cè). v%>$?+>  首先,將20g碳酸鈉溶于500ml水中;再將1g CuSO4.5H2O和2

25、g酒石酸鈉溶于500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液,儲(chǔ)存于冰箱中,可穩(wěn)定保存1年以上. jKN5K9  Folin-ciocalteu酚試劑 ? u5dyr  按體積比1:2:1將銅/酒石酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室溫下儲(chǔ)藏,可穩(wěn)定保存2周,標(biāo)明為試劑A e 9P#r  按體積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合,室溫下儲(chǔ)存于琥珀色試劑瓶中,可穩(wěn)定保存1個(gè)月,表明為時(shí)機(jī)B -hF:Wb%  用蒸餾水將樣本(5-100g)稀釋為1ml,并準(zhǔn)備100,50,25,

26、12.5g /ml,4個(gè)濃度的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白. 2dp8UP  每個(gè)蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鐘. 42wwNS  加入0.5 ml試劑B并立即混合, 在室溫下孵育30分鐘. 0X'+<BV-  在750nm光波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本蛋白質(zhì)的濃度. J cgc:7  #Jw2  3)紫外分光光度法: MH43Rw4  檢測(cè)原理:是因蛋白質(zhì)樣品在280nm波長(zhǎng)下有最大吸光率,最大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在. zfUbIjjSZ  純化蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定:在2

27、80nm波長(zhǎng)下讀取與適當(dāng)對(duì)照相比較的吸光值. tN)(pmRb  對(duì)于抗體和BSA,可按照下述標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其濃度,對(duì)其他蛋白質(zhì)粗略地估計(jì):1單位吸光值相當(dāng)于1mg/ml "LvrW%(zc  蛋白質(zhì) A280(1mg/ml) yM|Qc  IgG 1.35 <bc|z  IgM 1.2 Cwz0cBwX  BSA 0.7 t+GBz%6f6  含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液濃度的測(cè)定: _ 32VM  蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260) NA3,V7s  蛋白質(zhì)濃度(mg/

28、ml)=A205(27+120A280/A205) Q8BU*k,  GB;x_0 td8  1)SDS-PAGE設(shè)備和材料 ,pZ.>=tdj  電泳裝置（垂直板電泳槽）為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-24D型電泳裝置。 fY v5RT  電泳儀（電源）為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8B型。 &)#AbT  振蕩器 7fvkKL  -I-Oac$  2）試劑 "l/,MJ(  丙烯酰胺（電泳級(jí)） Y) w'_|  N,N-甲叉雙丙烯酰胺（bis） c'Di<

29、d;  SDS 9w* pK  TEMED -,?N=XZ  Tris vJfH9j  過(guò)硫酸銨 8k4Ket)  -巰基乙醇或DTT 1"T/f6$YNc  甘油 moDVP7x  甘氨酸 KWg7#a  溴酚藍(lán) rb&p*b  (11)鹽酸 Rx6 C  H5:gkGr  3）聚膠前準(zhǔn)備： k&s%?  配制凝膠儲(chǔ)液： T%=30% C%=1% arc:bis=29:1過(guò)濾后4避光保存。 B:4 bl-  配制濃縮膠緩沖液： 1.0mo

30、l/L TrisHCl Ph6.8, 過(guò)濾后4避光保存。 ?8 '8SAt  配制分離膠緩沖液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 過(guò)濾后4避光保存。 B*jM.U<  配制10%SDS Da/ewvo  配制10%過(guò)硫酸銨（AP） DXNgAx  TEMED原溶液 0,FQ*  電泳緩沖液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,臨用時(shí)稀釋5倍至1×SDS電泳緩沖液加入電泳槽中。 ;oAsf  (<5Sat9W  4)制膠: 制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)

31、間,最好是分離膠聚合控制在分離膠從加入10%AP和TEMED起至開始出現(xiàn)凝膠的時(shí)間為15-20分鐘（并不是此時(shí)已凝聚完全）。對(duì)濃縮膠最佳聚合速度為8-10min開始可見聚合，可以通過(guò)調(diào)節(jié)AP和TEMED的加入量來(lái)控制，因液體中含有分子氧可抑制凝膠的聚合，故用時(shí)可在真空中抽氣以排除液體中的分子氧，灌完分離膠后加水以封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合，總之，要掌握一個(gè)原則：即用盡量少的催化劑在最佳時(shí)間聚合。 j-Pwjw0  按比例配制分離膠，輕緩地?fù)u動(dòng)溶液（8-10下），使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，然后靜置90

32、min。 VH15-m  同前按比例配制濃縮膠，但搖動(dòng)溶液時(shí)不要過(guò)于劇烈以免引入過(guò)多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制90min以上以保證完全聚合。 oKtoS,c   E_ws  5)預(yù)電泳： 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽電泳緩沖液后低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳（恒壓10-20V,20-30min），清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過(guò)程中電泳的暢通。 a0&aLE!t"  iaix4Zx  6)加樣： 預(yù)電泳后依次

33、加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品，注意加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。 TorooKQ  tqO:-#Ox  7)電泳： 加樣完畢，蓋好電泳槽的蓋子并選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳，通常在連續(xù)系統(tǒng)中，上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓，使樣品更好的進(jìn)入凝膠，電泳時(shí)，應(yīng)采用恒壓的模式，這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移率。一般采用恒壓濃縮膠80V，分離膠120V，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。 hi>g6&i'.  8)染色和脫色 f=tdsY  電泳完畢需通過(guò)染色和脫色評(píng)

34、定其結(jié)果的優(yōu)劣.對(duì)凝膠中分離成不同條帶的蛋白進(jìn)行檢測(cè).此外,根據(jù)不同的研究目的,也可將凝膠電印跡 f:p:sj2TT  考馬斯亮藍(lán)染色: ."s/  將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中到如少量的染色液,以浸沒凝膠為宜,在搖床上震蕩,直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止,一般5-6小時(shí)或者4過(guò)夜;然后傾去染色液，用脫色液洗滌震蕩,其間要不斷換脫色液,直至脫色液顏色稍清亮.,凝膠背景清楚為止. + kE3+  染色液配制: YV(ZCm/  90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250用濾紙過(guò)濾染

35、液以除去顆粒不溶性物質(zhì). ;Y8L"GY  脫色液的配制: j/q(8?  90mL(甲醇):H20(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液. p>kP,E?  YeD .bYD  附： yF4qnDX  一、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的選擇 ' zvacL  凝膠電泳中一個(gè)關(guān)鍵的指示系統(tǒng)，即蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Molecular Weight Marker），電泳的分離效率，轉(zhuǎn)膜效率以及電泳泳動(dòng)情況等，皆需通過(guò)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)顯示，目前普遍采用的幾種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品有： p 5M te9  /(Cg'5 *y   B

36、lue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix o=K|ju   Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker #vCBWR  Mix GZOw$E My7  以上兩種Marker均為PIERCE公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為：prod# 26681; prod# 26691;該標(biāo)準(zhǔn)蛋白不需染色，在電泳凝膠中隨著蛋白質(zhì)的遷移，各種分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白逐漸分開，而顯示出非常漂亮的多色條帶，可通過(guò)電泳槽直接肉眼觀察各電泳帶的凝膠中的泳動(dòng)

37、情況，當(dāng)相對(duì)于目的蛋白大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白與相鄰兩條標(biāo)準(zhǔn)蛋白達(dá)到所需分辨距離時(shí)，即可停止電泳，取出凝膠做進(jìn)一步的轉(zhuǎn)膜工作。 i#76'ex   Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein 0.s?0MK  Molecular Weight Marker Mix ( SC oe+  以上也為PIERCE產(chǎn)品，貨號(hào)為：prod# 26651，該標(biāo)準(zhǔn)蛋白同上也具有以上作用外，同時(shí)在使用化學(xué)發(fā)光時(shí)，和樣品一起顯色經(jīng)膠片曝光后，在膠片上可出現(xiàn)漂亮的條帶。 p7m?ugvs  ?&Q29&q

38、uot;3V   Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix &c%IP'  以上為Sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為B2787,作用效果同 Leo8+  %NBp2h.Z  二、對(duì)照的設(shè)置 yae$bHAV  一般需要設(shè)立: "ej%mMv&>  內(nèi)參照, 提示系統(tǒng)的穩(wěn)定性,一般是一些管家蛋白 c>P?h"*5S  陽(yáng)性對(duì)照, 即肯定可以表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞,同時(shí)可以提示你一抗的質(zhì)量 /04  陰性對(duì)照: 即肯

39、定不會(huì)表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞.在實(shí)驗(yàn)中 r"|hJ&  根據(jù)你的需要選擇 r &PP!D  免疫印跡 Tz7KSiT+  蛋白質(zhì)印跡法是將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-PAGE后,分離為不同條帶,其中含有能與特異性抗體(或McAb)相應(yīng)的待檢測(cè)的蛋白質(zhì)(抗原蛋白),將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上此過(guò)程稱為blotting,以利于隨后的檢測(cè)能夠的進(jìn)行,隨后,將NC膜與抗血清一起孵育,使第一抗體與待檢的抗原決定簇結(jié)合(特異大蛋白條帶),再與酶標(biāo)的第二抗體反應(yīng),即檢測(cè)樣品的待測(cè)抗原并可對(duì)其定量. W4paf  一、 設(shè)備和材

40、料 G4g?QM  轉(zhuǎn)移電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳儀(電源) +" #-  震蕩器 xzG#XV  冰箱 GZ= 7XKL(  濾紙 "Ls_k-3#  NC膜 a p X  膠片 ;&aXp2rnys  暗室 Npx+ MC  二、 試劑 dyQ% 7yN'<  封閉液:5%的脫脂牛奶粉TBS-T kI_ov:;y  第一抗體(Ab1) b_'W;  第二抗體(標(biāo)記的Ab2) k=Mw  底物以及顯色指示劑 vJ&Vrr5)

41、 漂洗液(TBS-T) '5 K:L!  轉(zhuǎn)印緩沖液 V759r8WP  抗體稀釋液 0g:f XV  麗春紅S Ovh>(#  顯影液 u s  定影液 GgNBS)  三、 試劑的配制 ;wD-s,R?Y  封閉液: 5g的脫脂牛奶+100ml的TBS-T v*s.0y k  漂洗液(TBS-T): 0.01M TBS-T為Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl調(diào)節(jié)PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml $ +/

42、 7:  轉(zhuǎn)印緩沖液: 同5×SDS電泳緩沖液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以 YoT&E>*  Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需調(diào)節(jié)PH值 ,用時(shí)稀釋5倍到1×轉(zhuǎn)印緩沖液. riJkh3sso  顯影液：H2O-750ml j ,J$?  米土爾-3g u-%OLo4'D  無(wú)水亞硫酸鈉-100g p+T>iY  對(duì)苯二酚-3g soGFHUW  溴化鉀-3g ehvIRBvmS  無(wú)水碳酸鈉：先加5

43、gPH10.0不夠時(shí)再加5g h(6k)Ir  注：以上配定加H2o定容至1000ml U >X&A  定影液：起始水溫：60 H2o 700ml _cXcA  硫代硫酸鈉：240g d ? /  無(wú)水亞硫酸鈉：25g J =v!)ix  冰醋酸：48ml * rS>(<  注：加H2o至1000ml C Uq3Nc  gfp NUq;%  四、電印跡 s=Ih:m  蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，必須從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物具有牢固結(jié)合蛋白又不影響蛋白質(zhì)Ag活性

44、，而且支持物本身還有免疫反應(yīng)惰性等特點(diǎn)，常用的支持物有：硝酸纖維膜（NC膜）或PVDF膜。 S5hu%rQB  蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過(guò)程普遍采用電轉(zhuǎn)印法，分為半干式和濕式轉(zhuǎn)印兩種模式。 0e_$x4:C  5,#Kl=:3l  一 半干式電轉(zhuǎn)印 L9 v ZG0  1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取凝膠方法：用刀片將兩玻璃板分開，將多余的凝膠劃去，上部以濃縮膠為準(zhǔn)全部棄去，下部以分子量標(biāo)準(zhǔn)最小分子帶下一點(diǎn)全部劃去，取一10ml注射器注滿轉(zhuǎn)印緩沖液，插入玻璃板與凝膠之間注水，使水的壓力將兩者自

45、然分開,邊推邊進(jìn),反復(fù)多次注水,直至凝膠從玻璃板上滑落下來(lái)。 (G.>%oSq  2. 將NC膜和濾紙切出與凝膠一樣大小，置轉(zhuǎn)移緩沖液中濕潤(rùn)5-10min. OWl_; _y:e  3. 按照以下順序放置濾紙，凝膠和NC膜到半干槽中。 G%_KDs-w  f)Hl%j  T% gr|o  4. 每層之間的氣泡要全部去除。可以用10ml吸管輕輕在上一層滾動(dòng)去除氣泡，然后用一絕緣的塑料片中間挖空與凝膠一樣大小或略小一點(diǎn)，以防電流直接從沒有凝膠處通過(guò)造成短路，蓋好加上陽(yáng)極電極板。 'lUGBjp P  "S81&am

46、p;  二濕式電轉(zhuǎn)印 ,+z4v'0-  1.   Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取出凝膠方法同半干式電轉(zhuǎn)印。 p;u<7  2.   打開電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與NC膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，最后將NC膜平放在凝膠上，去除氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。 &sO$G.?  3.   電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)（電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰

47、箱內(nèi)預(yù)冷），連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NC膜應(yīng)對(duì)電泳槽的正極。 Cj0' dc9Ja  #1B !Bq  H"H%?vlx%  EwZHb/  五、印跡膜上總蛋白的染色 N|B9)j>  在確定印跡中是否存在總蛋白之前,通過(guò)對(duì)硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋白質(zhì)的組成情況,并可確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記物的位置和確定轉(zhuǎn)印成功,同時(shí),該方法也清楚地顯示出轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的復(fù)雜性. !FGM=J_  oPD Y-w'  麗春紅S印跡膜染色法： iGAlE  麗春紅S適用于酸性水溶液,染

48、色但是不持久,在后續(xù)的處理中紅色染料易被洗去,由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆性的,該染色方法適用于所有顯示抗原的餓技術(shù), 麗春紅S帶負(fù)電荷,可以與帶正電賀的氨基酸殘基結(jié)合,同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合,從而形成紅色條帶. > /neX_  hl#2V  1)麗春紅溶液的配制: $SB| 2b(O  儲(chǔ)存液(10×)： 0.1g麗春紅溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,臨用前稀釋10倍為應(yīng)用液. 9| IY1  uX/S$ ftVA  2)操作步驟 |B7nn$  轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出印跡膜至于麗春紅S應(yīng)用液中,

49、并在室溫下攪動(dòng)5-10分鐘 Q/DDJ)rx  將膜放入PBS洗數(shù)次,每次1-2分鐘,并且更換PBS #jF=Yj  根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標(biāo)準(zhǔn)位置進(jìn)行標(biāo)記 eZl3kfg  至此膜可以用于封閉和加入抗體 far y1  x ?5>? /  六、膜的封閉 kcog(Sd 5M  在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對(duì)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%馬血清以及5% No-fat milk等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測(cè)試劑相適

50、應(yīng)，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用檢測(cè)試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以20%BSA效果較好，其次是5%N-fat milk. =yW8NQca  封閉過(guò)程： xtUTOV  1) 洗轉(zhuǎn)印膜：室溫漂洗3次x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。 PjKSX0+k  2) 取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉2h，也可在4度過(guò)夜。 AGjRc  3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min. tAxdtBu  f#q2Bv:

51、  七、抗體雜交 8 OJ_Ei  抗體表面主要采用間接法。即先加入未標(biāo)記特異性抗體（Ab1）與膜上抗原結(jié)合，再加入標(biāo)記的抗抗體（Ab2）進(jìn)行雜交檢測(cè)，標(biāo)記Ab2 物質(zhì)有放射性核素，酶，以及生物素等。 ;gq5M,=$  雜交過(guò)程： I?3/d,z  ）封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的Ab1濃度為1ug/ml，封口，4孵育過(guò)夜或室溫（22-25）搖動(dòng)孵育2h. H0$>q0h  ） 液洗膜3次x10min (Bv15  ）標(biāo)記的Ab2（羊抗兔-HRP）室溫1h，洗膜3x10min >GYD'&xJ  -8 6+)2/  八、檢測(cè) |#Y2sM  根據(jù)標(biāo)記Ab2的標(biāo)記物不同,其雜交的結(jié)果檢測(cè)方法也不同,較