引物設計的幾點重要原則

1、PCR引物設計的11條黃金法則1 .引物最好在模板 cDNA的保守區(qū)內設計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件(比如 DNAman)比對(Alignment),各基因相同的序列就是該基因 的保守區(qū)。2 .引物長度一般在1530堿基之間。引物長度(primerlength)常用的是18-27bp,但不應大于 38,因為過長會導致其延伸溫度 大于74 C,不適于TaqDNA聚合酶進行反應。3 .引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72 C。GC 含量( composition )過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的

2、GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm 值( meltingtemperature )是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核甘酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于 Tm值510 CO若按 公式Tm=4 (G+。+2 (A+T)估計引物的Tm值，則有效引物的 Tm為5580C,其Tm值最 好接近 72以使復性條件最佳。4 .引物3'端要避開密碼子的第 3位。如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。5 .引物3'端不能選擇A,最好選擇To引物3'端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的

3、差異，當末位的堿基為 A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T 時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、 C錯配的引發(fā)效率介于 A、T之間，所以3端最好選擇To6 .堿基要隨機分布。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)(Falsepriming) 。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚喋吟或聚嘴咤的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。7 .引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構( Hairpin)使引

4、物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續(xù)4 個堿基的 互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免Crossdimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話，3端的互補重疊以防止引物二聚體( Dimer與4 個堿基的互補。應盡量使其 G 值不要過高(應小于4.5kcal/mol ) 。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。G8 .引物5'端和中間NG值應該相對較高，而 3端炭值較低。 G 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性，值越大，則雙鏈越

5、穩(wěn)定。應當選用5'端和中間4G值相對較高，而 3'端4G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3'端的4G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA聚合反應。 （不同位置的 G 值可以用Oligo6 軟件進行分析）9 .引物的5端可以修飾，而 3端不可修飾。引物的5'端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物 5'端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3畚;引入蛋白質結合 DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3端開始的，不能進行任何修飾。3端也

6、不能有形成任何二級結構可能。10 . 擴增產物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區(qū)域。用有關軟件（比如 RNAstructure）可以預測估計 mRNA的穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（ G° ）小于58.6lkJ/mol 時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用 7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。11 . 引物應具有特異性。引物設計完成以后， 應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。附：值得一提的是，

7、各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的 PCR因為產物序列 相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。做RealTime時用于SYBRGreen法時的一對引物與一般PCR的弓I物，在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求：1）避免重復堿基，尤其是G.2）Tm=58-60 度。3） GC=30-80%.4）3'端最后5個堿基內不能有多于 2個的G或C.5）正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。6）PCR擴增產物長度：引物的產物大小不要太大，一般在80-2

8、50bp之間者B可；80150bp最為合適（可以延長至300bp） 。7）引物的退火溫度要高，一般要在60 度以上；要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA 污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。至于設計軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESSZ 該可以的。做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備-尋找合適的引物非常不容易。關于BLAST的作用應該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設計

9、的這個引物，在已經發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那么這個引物的特異性就很差，從而不能用。1 簡介寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個擴增反應成功的關鍵。所選的引物序列將決定PCR 產物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm 值這個和擴增物產量有關的重要物理參數。好的引物設計可以避免背景和非特異產物的產生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產量：若使用設計粗糙的引物，產物將很少甚至沒有；而使用正確設計的引物得

10、到的產物量可接近于反應指數期的產量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應條件白優(yōu)化，比如調整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞碉、甲酰胺和甘油。計算機輔助引物設計比人工設計或隨機選取更有效。一些影響PCR反應中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計算機軟件中被編碼和限定。計算機的高速度可完成對引物位置、長度以及適應用戶特殊條件的其他有關引物的變換可能性的大量計算。通過對成千種組合的檢測，調整各項參數，可提出適合用戶特殊實驗的引物。因此通過計算機軟件選擇的引物的總體“質量 ”（ 由用戶在程序參數中設定）保證優(yōu)于通過人工導出的引物。需要指出的是，引物不必與模板完

11、全同源，因此可包含啟動子序列、限制酶識別位點或5端的各種修飾，這種對引物的修飾不會妨礙 PCR反應，而會在以后使用擴增子時發(fā)揮作用。2 .基本PCR引物設計參數引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發(fā)生錯誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會產生額外無關和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對引物擴增的產物與理論上成倍增長量的接近程度。 引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設置在近于引物Tm值（引物 / 模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內，18 到 24 個堿基的寡核苷酸鏈是有很好

12、的序列特異性的。引物越長，擴增退火時被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應，使用確保溶解溫度不低于54的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性?？偟膩碚f，最好在特異性允許的范圍內尋求安全性。每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數應用的最短引物長度為 18個核甘酸。引物設計時使合成的寡核甘酸鏈 （18 24 聚物）適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。 引物的二級結構包括引物自身二聚體、發(fā)卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于引物的3'末端形成的二聚體，應控制其 AG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有

13、進一步形成更穩(wěn)定結構的可能性，引物中間或 5端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結構，也以3端或近3端對引物-模板結合影響更大；影響發(fā)卡結構的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結構形式亦有很大的關系。應盡量避免3末端有發(fā)卡結構的引物。引物GC含量和Tm值PCR引物應該保才I合理的 GC含量。含有50%的G+C的20個堿基的寡核甘酸鏈的 Tm值大概在5662c范圍內，這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調。協(xié)調性差的引物對的效率和特異性都較差，因為降低了Tm 值導致特異性的喪失。這種情況下引物Tm 值越高，其錯誤引發(fā)的機率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm

14、值低的引物對可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時，這種 GC含量和Tm值的協(xié)調非常關鍵。一般來說，一對引物的Tm值相差盡量不超過23攝氏度，同時引物和產物的 Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內較好。 引物的額外序列與退火溫度若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結合位點、限制酶切位點或者 GC發(fā)夾結構可以使用加長的引物。一般說來，引物5端添加無關序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進行4到 5 個擴增循環(huán)；然后在假定引物5端序列已經加入到模板中，計算得出的退火溫度下

15、進行其余的循環(huán)。在引物上添加限制酶位點時一個重要的考慮是大多數限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的5端有2 至 3 個非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個缺點是影響溶解溫度的精確計算，而這對于確定PCR 反應時的退火溫度又是必須的。對于低于20個堿基的引物，Tm值可以根據Tm=4(G+C)+2(A+T計算。而對于較 長的引物，Tm值需要考慮動力學參數、從 最近鄰位”的計算方式得到，現(xiàn)有的 PCR引物設 計軟件大多數都采用這種方式。 引物的 3 末端核苷酸組成引物3末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結果是非常重要的，而引物3末端最后5到 6 個核苷酸的

16、錯配應盡可能的少。如果3末端的錯配過多，通過降低反應的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應幾乎注定要失敗。引物3末端的另一個問題是防止一對引物內的同源性。應特別注意引物不能互補，尤其是在3末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產物和天然模板之間產生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴增成功。 引物3'末端的穩(wěn)定性由引物 3'末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的A Go此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則 3末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發(fā)。需要注意的是，引物 3'末端應盡量避免

17、 T。實驗證明，以T結尾的引物即使與 T,G或C錯配 仍可有效延伸。 PCR 產物的長度及在耙序列內的位置所有的計算機程序都提供對 PCR產物長度范圍的選擇。一般說來，PCR產物長度對擴增效率有影響。特定的應用情況下，PCR產物長度部分取決于模板材料。預期產物的特定長度經常取決于應用的需要。若目的是建立測定特異DNA 片段的臨床檢驗方法，120300bp的小DNA擴增產物可能是最好的。產物應具有好的特異性和高的產生效率， 并含有能用于探針捕捉雜交實驗的足夠信息。這一長度范圍的產物可以通過采用兩步擴增循環(huán)方法得到，從而減少擴增時間。其他PCR方法有不同的最佳產物長度。例如，通過定量的RNA-PC

18、R檢測基因表達時，產物 應該足夠大以便構成競爭性模板，這樣，產物和競爭物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產物一般在 250750bp范圍內。 補充說明若在cDNA序列內找尋PCR引物，需特別注意兩點：首先，盡力將引物和產物保持在mRNA的編碼區(qū)域內，因為這是生成蛋白質的獨特序列，不像3末端非編碼區(qū)域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使 RNA特異的PCR產物與從污染 DNA中產生的產物在大小上相區(qū)別。 若PCR的目的是克隆一個基因或 cDNA的特異序列，產物的大小是根據具體應用預選的。在這里，計算機程序可以提供關于期望區(qū)域側翼選擇引物對的信息。在選擇用來擴增來自不同物種DNA的弓I物時，應避開 mRNA的5'和3'末端非翻譯區(qū)序列，因為它們可能沒有任何的同源性。3簡并引物設計 設計簡并引物時，一定要檢查靶擴增區(qū)域選定氨基酸遺傳密碼的簡并度。很顯然，我們期望選擇簡并度最低的氨基酸，達到提高特異性的目的。 充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引