畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)資料整理

1、畢赤醉母表達(dá)系統(tǒng)之阿布王創(chuàng)作時間：二O二一年七月二十九日Mut+和 Muts畢赤酵母中有兩個基因編碼醇氧化酶一一AOX1及AOX2細(xì)胞中年夜大都的醇氧化酶是 AOX1基因產(chǎn)物，甲醇可緊密調(diào)節(jié)、誘導(dǎo) AOX1基因的高水平表達(dá)，較典范的是占可溶性卵白的30犯上.AOX1基因調(diào)控分兩步：抑制/去抑制機(jī)制加誘導(dǎo)機(jī)制.簡單來說， 在含葡萄糖的培養(yǎng)基中，即使加入誘導(dǎo)物甲醇轉(zhuǎn)錄仍受抑制.為此，用甲醇進(jìn)行優(yōu)化誘導(dǎo)時，推薦在甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng).注意即使在甘 油中生長（去抑制）時，仍缺乏以使AOX1基因到達(dá)最低水平的表達(dá)， 誘導(dǎo)物甲醇是 AOX1基因可辨表達(dá)水平所必需的.AOX1基因已被分 離，含AOX1啟動子的質(zhì)

2、?？捎脕碓鲞M(jìn)編碼外源卵白的目的基因的 表達(dá).AOX2基因與AOX1M因有97%勺同源性，但在甲醇中帶 AOX2S 因的菌株比帶AOX1基因菌株慢很多，通過這種甲醇利用緩慢表型 可分離Muts菌株.在YPD替母膏、卵白月東、葡萄糖）培養(yǎng)基中，不 論是Mut+還是Muts其在對數(shù)期增殖一倍的時間年夜約為2h.Mut+和Muts菌株在沒有甲醇存在的情況下生長速率是一樣的，存在甲醇的情況下,Mut+在對數(shù)期增殖一倍的時間年夜約為4至6個小時,Muts在對數(shù)期增殖一倍的時間年夜約為18個小時.菌株 GS115 X-33、KM71 和 SMD1168勺區(qū)另U時間：二O二一年七月二十九日GS115 KM71

3、和SMD1168?是用于表達(dá)外源卵白的畢赤酵母受 體菌，與釀酒酵母相比，畢赤酵母不會使卵白過糖基化 ，糖基化后有 利于卵白的溶解或形成正確的折疊結(jié)構(gòu).GS115、KM71 SMD116酢組氨酸脫氫酶位點(diǎn)（His4）有突變，是組氨酸缺陷型，如果表達(dá)載體 上攜帶有組氨酸基因，可賠償宿主菌的組氨酸缺陷，因此可以在不 含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子.這些受體菌自發(fā)突釀成組氨酸野生型的概率一般低于10-8.GS115表型為Mut+,重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化GS115后，長出的轉(zhuǎn)化子可能是 Mut+,也可能是Muts（載體取代AXO1 基因），可以在MMR! MDW養(yǎng)基上鑒定表型.SMD1168和GS115類似，

4、但SMD116睡因組中的Pep4基因發(fā)生突變，是卵白酶缺陷型，可降 低卵白酶對外源卵白的降解作用.其中X-33由于是野生型，因此耐受性比力好，如果擔(dān)憂轉(zhuǎn)化率 的話可以考慮這種酵母菌，而X33與GS115一樣都是屬于 MUH暗 示型，也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，可是據(jù)說會對外源基因表達(dá)有影響，KM71的親本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突變，在不含精氨酸的培養(yǎng)基中不能生長.用野生型ARG4基因（約2kb）拔出到克隆的野生型 AOX1基因的BamHI（AOX1基因15/16密碼子）及 SalI（AOX1基因227/228密碼子）位點(diǎn)，取代了 AOX1基因16-227密 碼子，

5、此結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化至 KM71親本菌（arg4his4）中，分離發(fā)生 KM71 MutsArg+His-菌株,Arg+轉(zhuǎn)化子遺傳分析顯示野生型 AOX1被 時間：二。二一年七月二十九日aox1:ARG4結(jié)構(gòu)所取代，所以KM71所有轉(zhuǎn)化子都是 Muts表型,AOX1 位點(diǎn)沒有被完全缺失，理論上可用你的目的結(jié)構(gòu)通過基因取代方法 替換aox1:ARG4結(jié)構(gòu)，這樣重組菌株的表型是 His+MutsArg-,這意 味著重組菌株生長時需精氨酸.但僅添加精氨酸其實(shí)不能完全緩和 arg4突變的影響,arg4菌株在含精氨酸的最小培養(yǎng)基中不能很好 地生長.因此不推薦在KM71中通過取代aox1:ARG4結(jié)構(gòu)來獲得His

6、+轉(zhuǎn)化子.一般來說，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用 Muts細(xì)胞，這樣獲得的 卵白產(chǎn)物中醇氧化酶卵白量較少而目的卵白量相對較多，使下游純化更易進(jìn)行.而對分泌卵白的表達(dá)，無論是甲醇利用慢（Muts）還是 甲醇利用快（Mut+）的細(xì)胞都可應(yīng)用.基因重組Pichia.pastoris酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以 實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)，包括啟動子、外源基因克隆位點(diǎn)、 終止序列、 篩選標(biāo)識表記標(biāo)幟等.細(xì)菌內(nèi)同源重組被認(rèn)為是重組質(zhì)粒構(gòu)建過程 的難點(diǎn)，因?yàn)槲淳€性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低 所以重組轉(zhuǎn)移載體必需用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線

7、性化處置.這種處置的目的是防止隨機(jī)拔出重組時質(zhì)粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達(dá)失活，讓同源重組以指定的方式發(fā)生.表達(dá)載體主要分為以下幾類：（1）胞內(nèi)表達(dá)載體主要有 pHIL-D2、pA0815、 pPIC3K、 pPICZ、 pHWO10,pGAPZpGAPZa（Invitrogen）等.該類載體可以將目的基因表達(dá)在胞內(nèi)，可以防止畢赤酵母的糖基化，主要適合于那些不能被糖基化相關(guān)基因 的表達(dá)；（2）分泌型表達(dá)載體主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZ%、pYAM75游,由于畢赤酵母自己的泌內(nèi)源卵白非常少，將外源卵白分泌到胞外，非常有利于目的卵白質(zhì)的純化及積累.經(jīng)常使用的分泌的信號序列主要是

8、由89個氨基酸組成的 交配因子（ -factor）的引導(dǎo)；（3）多拷貝拔出表達(dá)載體如pPIC9K,pPIC3.5K.在某些情況下，畢赤酵母中重組基因多拷貝整合可增加所需卵白的表達(dá)量.該載體均可用于在體內(nèi)（pPIC3.5K, pPIC9K）或體外（pAO815）發(fā)生并分離多拷貝拔出，同時可檢測增加重組基因的拷貝數(shù)是否增加卵白 表達(dá)量.體內(nèi)整合可通過高遺傳霉素抗性篩選可能的多拷貝拔出，而體外整合可通過連接發(fā)生外源基因的串連拔出在GS115中篩選His+Mut+轉(zhuǎn)化子：用SalI或StuI線性化質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化GS115后，年夜多在His4位點(diǎn)上發(fā)生重組，年夜大都轉(zhuǎn)化子 是Mut+表型；然而由于質(zhì)粒含有A

9、OX1基因序列，有可能在AOX1位點(diǎn)發(fā)生重組，破壞野生型AOX1基因，發(fā)生His+Muts轉(zhuǎn)化子，則需要 在MW MMff板上檢測可證實(shí) His+ Mut+轉(zhuǎn)化子.線性化酶切位點(diǎn)拔失事件GS115表型KM71表型SalI 或 StuI拔出his4His+Mut+His+Muts畢赤SacI拔出5AOX1His+Mut+His+Muts酵母表達(dá)經(jīng)常BglII取代AOX1His+MutsHis+Muts(不推薦)使用培養(yǎng)基10XYNB(13.4%勺無氨基酸酵母氮源 ),134gYNB固體溶于1L蒸儲水, 過濾滅菌,4 C保管.YPD完全培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L,卵白月東20 g/L,葡萄糖2

10、0g/L(固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂).轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 RDB每100mL加入山梨醇 18g(186 g/L), 瓊脂糖 2g(20g/L)121c滅菌20分鐘，然后待溫度降至 60c以后在超凈臺 上加入 10X YNB 10mL(13.4 g/L),10 X葡萄糖 10mL(20 g/L),500 x 生物素 0.2mL(4X10-4g/L), 100XAA 1mL.混勻，倒平板(滅菌時只 加入80ml水即可).選擇培養(yǎng)基 MD最小葡萄糖)：配100mL，向80mL水中加入瓊脂糖 2g(20 g/L)121 C滅菌20分鐘，待溫度降至60c以后在超凈臺上加 入 10X YNB 10mL(13.4

11、g/L),10 X葡萄糖 10mL(20 g/L),500 x生物 素 0.2mL(4X10-4g/L).選擇培養(yǎng)基MM最小甲醇)：配100mL，向90mL7k中加入瓊脂糖2g(20 g/L) 121 C滅菌 20分鐘，待溫度降至 60c以后在超凈臺上加入 10X YNB 10mL(13.4 g/L),500 X 生物素 0.2mL(4 x 10 -4g/L),0.5mL 甲醇(0.5%).誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基 BMGY配1L,酵母提取物 10 g/L,卵白月東20 g/L,3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4,力口水至 890mL,121C滅菌 20 分 鐘，然后待溫度降至60c以

12、后在超凈臺上加入 10X YNB100mL(13.4 g/L),500 X 生物素 1mL(4X 10-4g/L),甘油 10mL.誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY酵母提取物10g/L,卵白月東20 g/L,3g/LK2HPO4,11.8g/L KH2PO4,力口水至 895mL,121C 滅菌 20 分 鐘，然后待溫度降至60c以后在超凈臺上加入100XYNB 100mL(13.4 g/L),500 X 生物素 1mL(4X 10-4g/L),甲醇 5mL.BMGY/BMMY酵母浸出物及卵白月東，可穩(wěn)定分泌卵白，阻止或減少分 泌卵白的分解.如果目的卵白對中性 PH卵白酶敏感的話，可在無緩 沖培養(yǎng)基(MGY