木瓜蛋白酶提取實(shí)驗(yàn)方案

1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題目：木瓜蛋白酶的提取 ,純化分離及其生物學(xué)研究一、 實(shí)驗(yàn)原理：木瓜蛋白酶（papain ）又稱木瓜酶，廣泛存在于番木瓜的根、莖、 葉和果實(shí)，未成熟果實(shí)的乳汁中含量最豐富 。是一種含疏基（ -SH） 肽鏈的內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng) 植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力；同時(shí)還具有合成的 功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質(zhì)。 工業(yè)用的木瓜蛋白酶一般都 是未經(jīng)純化的多酶體系。 現(xiàn)已知經(jīng)木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至 少含有四種主要酶類：木瓜蛋白酶（ papain ）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapa in）、木瓜蛋白酶 Q（ papaya prote

2、in ase Q）、木瓜 凝乳蛋白酶M（ chymopapain M）,其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多， 占可溶性蛋白的 45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油， 水溶液為無色或淡黃色， 有時(shí)呈乳 白色；幾乎不溶于有機(jī)溶劑。它的最適pH直為5.7 （一般39.5皆可）， 在中性或偏酸性時(shí)亦有作用；最適溫度為5560C （般1085C皆 可），耐熱性強(qiáng)，在90C時(shí)也不會(huì)完全失活；受氧化劑抑制，還原性 物質(zhì)激活。本實(shí)驗(yàn)主要采取有機(jī)溶劑沉淀法結(jié)合硫酸銨分級(jí)沉淀法來 提取番木瓜中的木瓜蛋白酶有機(jī)溶劑沉淀法： 有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù)， 從而增加蛋 白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)溶解度的降低，另外，有機(jī)溶劑與

3、水 的作用， 能破壞蛋白質(zhì)的水化膜， 故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中 的溶解度差異而分離的方法。 有機(jī)溶劑分段沉淀法它常用于蛋白質(zhì)或 酶的提純。 使用的有機(jī)溶劑多為乙醇和丙酮。 高濃度有機(jī)溶劑易引起 蛋白質(zhì)變性失活， 操作必須在低溫下進(jìn)行， 并在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意 攪拌均勻以避免局部濃度過大。硫酸銨分級(jí)沉淀法： 硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和 部分純化蛋白質(zhì)。 高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水 分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中 沉淀出來。 各種蛋白質(zhì)的溶解度不同， 因而可利用不同濃度的鹽溶液 來沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。 鹽析時(shí)溶液P

4、H在木瓜 蛋白酶等電點(diǎn)時(shí)( PI=8.75 )則效果最好 ，鹽濃度通常用飽和度來表 示。硫酸銨因其溶解度大， 溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最 廣。木瓜蛋白酶活力測定：蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質(zhì)中的肽鍵， 也能夠水解 酰胺鍵和酯鍵，因此可用蛋白質(zhì)或人工合成的酰胺及酯類化合物作為 底物來測定蛋白酶的活力。 本實(shí)驗(yàn)選用酪蛋白為底物， 測定微生物蛋 白酶水解肽鍵的活力。 酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后， 降解成相對(duì)分子質(zhì)量 較小的肽和氨基酸， 在反應(yīng)混合物中加入三氯乙酸溶液， 相對(duì)分子質(zhì) 量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來， 相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯乙酸溶液中的肽的數(shù)量正比

5、于酶的數(shù)量和反 應(yīng)時(shí)間。在280nm波長下測定溶液吸光度的增加，就可計(jì)算酶的活力。酶活力單位定義：在規(guī)定條件下，1min內(nèi)酶水解酪蛋白釋放出 相當(dāng)于1ug/ml酪氨酸在275nm波長處的吸收度為1個(gè)活力單位。以 0.1mol/l鹽酸溶液做空白，在275nm波長處測定空白溶液，待測定 液，對(duì)照品溶液的吸光度。飽和硫酸銨溶解曲線：O也町OO 小 o Q1 0 dh s 7 6 5 斗 3 2 1 Ll .1 潯解度g2040008060(NH4X2SO4熱飽和溥液一合成TKC1*產(chǎn)品、實(shí)驗(yàn)材料與儀器材料：未成熟的番木瓜，無水乙醇，0.05mol/L磷酸氫二鈉；0.1mol/L HC1乙二胺四乙酸二

6、鈉固體；氫氧化鈉固體，酪蛋白固體，半胱氨酸固體，氯化鈉固 體，三氯乙酸固體，硫酸銨粉末，乙酸鈉固體，和冰乙酸溶液，EDTA儀器：高速組織搗碎機(jī)，水浴箱，精確 pH計(jì)，紫外分光光度計(jì)，高速冷凍離 心機(jī)，精密電子天平，低溫冰箱。三、技術(shù)路線試劑配制材料準(zhǔn)備第次純化乙醉提耳無法第二次純化四、實(shí)驗(yàn)步驟4.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：所需試劑的配制以及考馬斯亮藍(lán)G-250法測蛋白含量的預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保試驗(yàn)方法的可行性?？捡R斯亮藍(lán)G-250染液（0.01%）：稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250固體粉末，溶于50mL 95%S醇中（95匯醇取實(shí)驗(yàn)室無水乙醇 47.5mL加2.5mL蒸餾水）再加入86%磷酸100mL倒入1000

7、mL容量瓶加蒸餾水定容至1000mL靜置1h后，取棕 色試劑瓶用乙醇清洗干凈用濾紙過濾溶液后封存。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液( 0.1mg/mL): 準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白 0.01g 用蒸餾水溶解并稀釋 到100mL現(xiàn)配現(xiàn)用。酶保護(hù)劑：準(zhǔn)確稱量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH至9.0，溶 解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA定容至250ml，轉(zhuǎn)入棕色瓶中。500ml的2%(m/v)碳酸氫鈉和1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液：稱取10g的碳酸氫鈉 和0.1871g的EDTA溶于 500ml蒸餾水中，調(diào)節(jié) PH至8.0。500ml的 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液

8、：稱取 0.1871g 的EDTA溶于 500ml蒸餾水中，調(diào)節(jié) PHS8.0。酪蛋白溶液：稱取酪蛋白0.6g加入0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液80mL(取1.433g 磷酸氫二鈉固體加80mL蒸餾水即得溶液)，置沸水浴中煮30min，時(shí)時(shí)攪拌，冷 卻至室溫。加1M鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.0 0.1。加蒸餾水稀釋到100mL用前配置。酶稀釋液：A液稱取半胱氨酸0.264g，氯化鈉1.17g，加蒸餾水25ml溶解；B液稱取乙二胺四乙酸二鈉0.112g，加蒸餾水10ml溶解；合并A、B液，攪拌均勻，用4.0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值到5.5，加蒸餾水稀釋至 50mL 。用前配置。三氯乙酸溶液：取

9、三氯乙酸0.9g，加乙酸鈉1.495g和冰乙酸0.95mL,加水溶解并稀釋至 50mL。4.2 木瓜蛋白酶提取粗酶液提?。?用薄的不銹鋼刀片沿未成熟的番木瓜的縱線將果皮割破，深度為 23mm根據(jù) 果實(shí)大小的不同，每個(gè)果實(shí)可以 510條刀口。 將木瓜放于一個(gè)大燒杯中，使木瓜乳汁流入大燒杯中。 收集10ml乳汁加入190 ml蒸餾水水，勻速輕柔攪拌1h,得漿液 漿液用8層紗布進(jìn)行過濾，將所得液分裝到離心管中，用離心機(jī)在3500r/min的 條件下，離心15mi n。 收集上清液至一潔凈的試管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20 C存取10ml酶原液(編號(hào)為酶液1)。粗酶液純化：將粗液放入冰桶中，加入適量

10、酶保護(hù)劑(0.04mol/L的半胱氨酸和0.004 mol/L的EDTA，混勻后如下表加入試劑。酶液+保護(hù)劑(ml)硫酸銨粉末(至終濃度20%) (g)硫酸銨粉末(至終濃度的 40%)(g)酶液+ 保護(hù)劑(ml)冷無水乙醇(65%)(ml)酶70+10148.6調(diào)節(jié)原ph為液36.0，酶70+10置于20靜置30min，離22靜置30min，離取1ml9+118.64C靜原冰桶心 4000r/min，心 4000r/min，酶液置過液4中30min，棄沉淀30min，取沉(酶夜淀，加10ml蒸液餾水2 ），-20 °C保存對(duì)過夜的酶液繼續(xù)處理酶液+硫酸銨硫酸銨保護(hù)劑粉末粉末(ml)(

11、至終(至終濃度濃度20%)40%)(g)(ml)酶4 °C4000 r / min取1ml9+1置2.5靜置30min,2.7靜置30min,取1ml透取酶原靜離心30酶液冰離心離心酶液析液并液置min ,取沉(酶桶4000r/min,4000r/min,(酶袋編號(hào)3過淀，分別加液中30min，棄沉30min，取沉液4)，處酶液夜加10ml蒸3 )，淀淀，加入-20 C理6，餾水-20 C10ml蒸餾水保存-20 C保存保存酶編號(hào)酶液5，-20C保存透取酶原析液并液袋編號(hào)4處酶液理7，-20 C保存423透析：8000-14000標(biāo)號(hào)的透析袋處理： 取透析袋剪成適當(dāng)長度的小段。放入大

12、體積的2%(m/v)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸10分鐘。 用蒸餾水徹底漂洗透析袋。放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將之煮沸10分鐘。 冷卻后，存放于4度，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時(shí)起取用透析袋是必須戴手套，在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，將之清洗干凈。 系好透析袋的一端，從另一端注入酶液 4、5,將透析袋放入蒸餾水中，在搖 床上震蕩，時(shí)時(shí)換蒸餾水。 直至向蒸餾水中加入氯化鋇溶液，無沉淀產(chǎn)生及透析除鹽完成。取出蛋白質(zhì)溶 液。4.3木瓜蛋白酶活性及總蛋白含量測定：酶活性的測量酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液和酶液處理酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的制備：精密稱取酪氨酸0.005

13、g用O.1mol/L鹽酸溶解并定容至100mL (此為50ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液)酶液的處理：取0.3ml酶液，加酶稀釋液2.7ml，稀釋至3mL操作待測液：準(zhǔn)確量取酶液溶液各1.0mL，分別置于2支10mL帶塞試管中，于 50度水浴預(yù)熱5分鐘，準(zhǔn)確加入50度預(yù)熱的酪蛋白溶液5mL立即振搖，置50 度水浴中，精確反應(yīng)10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL，振搖，于50度水浴中 放置40min,用干燥濾紙過濾，濾液在2h內(nèi)采用分光光度法以水為空白，在275nm 的波長處測定吸光度A。空白對(duì)照液：再精確量取酶液 1.0mL，置于10mL具塞試管中，于50度水 浴預(yù)熱5min,準(zhǔn)確加入50度預(yù)熱的蒸餾水

14、5ml,置50度水浴中，加入三氯乙酸 溶液5ml，振搖，于50度水浴中放置40min，用干燥濾紙過濾，濾液在 2h內(nèi)采 用分光光度法以水為空白，在 275nm的波長處測定吸光度A0。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液：另取酪氨酸對(duì)照溶液，以蒸餾水為空白，在275nm的波長處測定吸光度An。酶液(ml)50度預(yù)熱 的三氯乙酸(ml)吸光度待測液1.050度水域 預(yù)熱5min酪蛋白溶液5ml50度水浴10min5.0震搖，50度水 浴 40min過濾，濾液以水為對(duì)照在275nm測吸光值，A1 A2A1.05.0空白対照液1.0蒸餾水5ml5.0A0酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液取酪氨酸溶液，以蒸餾水為空白，測寸定吸光度An酶活力單位定義

15、為在測定條件下,每1 min生成1卩g/mL酪氨酸所需的酶量 公式：酶活力（U/g）=A Ao Wi11 n 1000AnW2 10式中：W1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液每1 mL中含酪氨酸的量，單位為微克（ug ）；10 反應(yīng)時(shí)間；11 測定總體積；n待測液的稀釋倍數(shù)；1000毫克與克的轉(zhuǎn)換倍數(shù)。在上述條件下，每分鐘水解酪蛋白生成1 yg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單 位。酶含量的測量：取8支15 mL試管，按下表加入試劑管號(hào)12345678蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.10.20.30.40.60.81.O蒸餾水（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考馬斯亮藍(lán)（ml）4.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)含量（ug）0102030406080100A595將試管搖勻，放置2-3分鐘。用分光光度計(jì)比色測定吸光值A(chǔ)595