2酶譜法檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMPMMP9的活性ppt課件

1、酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶酶MMP-2和和MMP-9活性活性綜合性設(shè)計性實(shí)驗(yàn)綜合性設(shè)計性實(shí)驗(yàn)-2-2此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個部分此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個部分第一部分，電泳技術(shù)簡介第一部分，電泳技術(shù)簡介第二部分，酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶第二部分，酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和和MMP-9的活性的活性第三部分，食管癌患者血液中第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和和MMP-9的的活性變化及其臨床意義活性變化及其臨床意義第一部分，電泳技術(shù)簡介第一部分，電泳技術(shù)簡介按支持介質(zhì)的不同可分為：按支持介質(zhì)的不同可分為：紙電泳紙電泳Paper electrophori

2、sis）醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳Cellulose Acetate electrophoresis）瓊脂凝膠電泳瓊脂凝膠電泳Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳Polyacrylamide Gel-electrophoresis） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE,十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳法）電泳法）按支持介質(zhì)形狀不同可它為：按支持介質(zhì)形狀不同可它為： 薄層電泳薄層電泳 板電泳板電泳 柱電泳柱電泳 電泳設(shè)備電泳設(shè)備垂直電泳系統(tǒng)垂直電泳系統(tǒng)水平電泳系統(tǒng)水平電泳系統(tǒng)聚丙烯酰

3、胺凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠電泳原理N,N-甲叉亞甲基甲叉亞甲基雙丙烯酰胺雙丙烯酰胺催化劑催化劑 丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；對對pHpH和溫度變化較穩(wěn)定；和溫度變化較穩(wěn)定；幾乎無吸附和電滲作用，只要幾乎無吸附和電滲作用，只要AcrAcr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；性好；樣品不易擴(kuò)散，且用量少，

4、其靈敏度可達(dá)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g10-6g；凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。SDSPAGE的原理的原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀聚丙烯酰

5、胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。而而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術(shù)首先是僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術(shù)首先是1967年由年由shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。SDS

6、Sodium Dodecyl Sulfate是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過

7、了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。因此在電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小。因此在電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小。不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運(yùn)動示意圖不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運(yùn)動示意圖不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對不同分子量的不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對不同分子量的蛋白質(zhì)混合物分離能力的關(guān)系蛋白質(zhì)混合物分離能力的關(guān)系5 5101015152929454566669797200200292945456666979720020029294545

8、66669797200200第二部分，酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋第二部分，酶譜法檢測血清中基質(zhì)金屬蛋白酶白酶MMP-2MMP-2和和MMP-9MMP-9的活性的活性腫瘤細(xì)胞的侵襲移動腫瘤細(xì)胞的侵襲移動CBAD腫瘤細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞粘附并穿越細(xì)胞外基質(zhì)，包括三個重要的步驟：腫瘤細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞粘附并穿越細(xì)胞外基質(zhì)，包括三個重要的步驟：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細(xì)胞經(jīng)缺口移動。粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細(xì)胞經(jīng)缺口移動。腫瘤細(xì)胞對周圍組織和血管的侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。腫瘤細(xì)胞對周圍組織和血管的侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在原灶外存活和增殖，這是癌癥對人類

9、生命的最大威脅。轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在原灶外存活和增殖，這是癌癥對人類生命的最大威脅。細(xì)胞間基質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)胞間基質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)主要成份由膠原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基主要成份由膠原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖組成。葡聚糖組成。ECM在上皮或內(nèi)皮細(xì)胞的基底部，即以基底膜在上皮或內(nèi)皮細(xì)胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存的形式存在，在細(xì)胞間結(jié)構(gòu)以間質(zhì)結(jié)締組織在，在細(xì)胞間結(jié)構(gòu)以間質(zhì)結(jié)締組織(interstitial connective tissue)形式存在。形式存在。膠原是膠原是ECM的主要

10、成分，目前已發(fā)現(xiàn)，至少有的主要成分，目前已發(fā)現(xiàn)，至少有12種不同膠原類型，其中以種不同膠原類型，其中以I、型膠原是間質(zhì)結(jié)締組織中的主要成分。型膠原是間質(zhì)結(jié)締組織中的主要成分。型膠原則主要存在于基底膜內(nèi)。型膠原則主要存在于基底膜內(nèi)。腫瘤細(xì)胞的侵襲是需要與細(xì)胞增殖、分化、移動的相關(guān)基因及其表達(dá)調(diào)控模式的改變腫瘤細(xì)胞的侵襲是需要與細(xì)胞增殖、分化、移動的相關(guān)基因及其表達(dá)調(diào)控模式的改變和促進(jìn)細(xì)胞移動的外界因素兩者的共同作用。和促進(jìn)細(xì)胞移動的外界因素兩者的共同作用。雖然腫瘤細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制還不是十分清楚，但已發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)雖然腫瘤細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制還不是十分清楚，但已發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)

11、移的關(guān)鍵分子及其信號通路。鍵分子及其信號通路。腫瘤細(xì)胞通過其表面受體與腫瘤細(xì)胞通過其表面受體與ECM中的各種成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶類來降中的各種成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶類來降解基質(zhì)，從而形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)行通道。一般惡性程度高的腫解基質(zhì)，從而形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)行通道。一般惡性程度高的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的蛋白水解作用，可侵蝕破壞包膜，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。目前較為關(guān)注的酶主瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的蛋白水解作用，可侵蝕破壞包膜，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。目前較為關(guān)注的酶主要是絲氨酸蛋白酶類，如纖溶酶原激活物要是絲氨酸蛋白酶類，如纖溶酶原激活物(plasminogen activator

12、, PA)和金屬蛋白酶和金屬蛋白酶(metalproteinase, MMP)類，如膠原酶類，如膠原酶IV、基質(zhì)降解酶、透明質(zhì)酸酶。、基質(zhì)降解酶、透明質(zhì)酸酶。MMPs家族成員根據(jù)其在細(xì)胞中表達(dá)部位的不同，分為胞質(zhì)型和膜型兩大類。前者分家族成員根據(jù)其在細(xì)胞中表達(dá)部位的不同，分為胞質(zhì)型和膜型兩大類。前者分布在胞質(zhì)中，后者表達(dá)在膜上。胞質(zhì)型布在胞質(zhì)中，后者表達(dá)在膜上。胞質(zhì)型MMPs根據(jù)其作用底物的特異性、敏感性及氨根據(jù)其作用底物的特異性、敏感性及氨基酸序列的同源性分為三大類：基酸序列的同源性分為三大類： （1間質(zhì)膠原酶，包括間質(zhì)膠原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物

13、主要為，其作用底物主要為間質(zhì)膠原間質(zhì)膠原, 即即、和和、型膠原型膠原, 但不能降解明膠和但不能降解明膠和型膠原；型膠原； （2明膠酶，包括明膠酶，包括MMP-2和和MMP-9,其作用底物主要是其作用底物主要是型膠原和明膠，還可降型膠原和明膠，還可降解解、型膠原型膠原,但不能降解間質(zhì)膠原；但不能降解間質(zhì)膠原； （3間充質(zhì)溶解素，包括間充質(zhì)溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和和MMP-11，其作用底物主，其作用底物主要是基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，如纖維粘連蛋白要是基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，如纖維粘連蛋白(FN)、層粘連蛋白、層粘連蛋白(LN)，間充質(zhì)溶，間充質(zhì)溶解素對膠原的作用不同于

14、間質(zhì)膠原酶和明膠酶，它們能降解解素對膠原的作用不同于間質(zhì)膠原酶和明膠酶，它們能降解、型膠原酶型膠原酶以及以及型膠原的氨基端。型膠原的氨基端。通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。 基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族MMP-2又叫明膠酶又叫明膠酶A， 其蛋白主要由纖維結(jié)締組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，分子量其蛋白主要由纖維結(jié)締組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，分子量為為72kDa。MMP

15、-9又稱為明膠酶又稱為明膠酶B，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞多形核白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞多形核白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。分子量為分子量為92kDa，是，是MMPs中分子量最大的酶。中分子量最大的酶。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是是1993年年Kjeldsen等人在研究等人在研究MMP-9在細(xì)胞內(nèi)存在形式時發(fā)現(xiàn)的，它能夠在細(xì)胞內(nèi)存在形式時發(fā)現(xiàn)的，它能夠與與MMP-9聚合形成異源二聚體，保護(hù)和調(diào)節(jié)聚合形成異源二聚體，保護(hù)和調(diào)節(jié)MMP-9活性，從而促進(jìn)惡變細(xì)胞

16、的浸活性，從而促進(jìn)惡變細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。潤和轉(zhuǎn)移。檢測檢測MMP-9和和MMP-2的活性，對分析腫瘤細(xì)胞惡性程度和預(yù)后提供幫助。的活性，對分析腫瘤細(xì)胞惡性程度和預(yù)后提供幫助。由由N 端的端的310螺旋、螺旋、C 端的端的螺旋和中間的和中間的八段反平行的螺旋和中間的和中間的八段反平行的折疊所構(gòu)成，這折疊所構(gòu)成，這八段反平行式八段反平行式折疊構(gòu)成了一個折疊構(gòu)成了一個折疊桶結(jié)構(gòu)。折疊桶結(jié)構(gòu)。此此折疊桶結(jié)構(gòu)一端是開放的，為與配體結(jié)合提供了進(jìn)口；而另一端則被短的折疊桶結(jié)構(gòu)一端是開放的，為與配體結(jié)合提供了進(jìn)口；而另一端則被短的N 端端310螺旋所封閉。在螺旋所封閉。在折疊桶底部內(nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪

17、族氨基酸殘基，折疊桶底部內(nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基，形成了一個疏水核或疏水內(nèi)部，為結(jié)合親脂性配體提供了位點(diǎn)。形成了一個疏水核或疏水內(nèi)部，為結(jié)合親脂性配體提供了位點(diǎn)。NGAL的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu)MMP-2的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)Pre: 信號肽序列信號肽序列Pro: 帶巰基的前肽帶巰基的前肽Zn: Zn離子結(jié)合部分離子結(jié)合部分II: 能結(jié)合膠原的能結(jié)合膠原的II型纖維結(jié)合素結(jié)構(gòu)域型纖維結(jié)合素結(jié)構(gòu)域H: 絞鏈區(qū)絞鏈區(qū)Hemopexin：類血紅素蛋白結(jié)構(gòu)，由四段重復(fù)序列組成，其中：類血紅素蛋白結(jié)構(gòu)，由四段重復(fù)序列組成，其中第一個與第四個間存在一第一個與第四個間存在一 個二硫鍵。個二硫鍵。MMP-9

18、的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)由三個由三個螺旋與螺旋與5個個折疊構(gòu)成折疊構(gòu)成含有含有2個鋅離子和個鋅離子和5個鈣離子個鈣離子右圖可見一個小分子化合物位于酶活性中心，并與一個鋅離子結(jié)合右圖可見一個小分子化合物位于酶活性中心，并與一個鋅離子結(jié)合NGAL能與能與MMP-9以二硫鍵的方式結(jié)合，能起到保護(hù)和調(diào)節(jié)以二硫鍵的方式結(jié)合，能起到保護(hù)和調(diào)節(jié)MMP-9功能的作用，所以功能的作用，所以NGAL與腫瘤的侵襲移動有密切的聯(lián)系。與腫瘤的侵襲移動有密切的聯(lián)系。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組以轉(zhuǎn)染有汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組以轉(zhuǎn)染有pcDNA3 空白質(zhì)?？瞻踪|(zhì)粒載體的載體的

19、SHEEC 細(xì)胞為對照，酶譜法檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染有細(xì)胞為對照，酶譜法檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染有pcDNA-NGAL (-) 的的SHEEC 細(xì)胞細(xì)胞分泌的分泌的MMP-9 和和MMP-2的活性均明顯降低；而與此同時，轉(zhuǎn)染有的活性均明顯降低；而與此同時，轉(zhuǎn)染有pcDNA-NGAL () 的的SHEEC 細(xì)胞分泌的細(xì)胞分泌的MMP-9 和和MMP-2的活性均明顯升高。表明通過有義、反義技術(shù)使的活性均明顯升高。表明通過有義、反義技術(shù)使NGAL 基因表達(dá)發(fā)生改變可以對基因表達(dá)發(fā)生改變可以對SHEEC 細(xì)胞分泌的細(xì)胞分泌的MMP-9 和和MMP-2 的活性產(chǎn)生明顯影響。的活性產(chǎn)生明顯影響。M：蛋白：蛋白mar

20、ker；1. 細(xì)胞培養(yǎng)基；細(xì)胞培養(yǎng)基；2. pcDNA3；3. pcDNA-NGAL ( + )；4. pcDNA-NGAL ( - ) MMP-2和和MMP-9活性的強(qiáng)弱與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的能力密切相關(guān)。明膠是這兩種酶的活性的強(qiáng)弱與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的能力密切相關(guān)。明膠是這兩種酶的底物。所以在體外通過酶譜法底物。所以在體外通過酶譜法Zymography檢測樣品組織，細(xì)胞培養(yǎng)液，血清，檢測樣品組織，細(xì)胞培養(yǎng)液，血清，血漿，尿中血漿，尿中MMP-2和和MMP-9的活性，對了解腫瘤細(xì)胞的惡性程度、監(jiān)測治療效果的活性，對了解腫瘤細(xì)胞的惡性程度、監(jiān)測治療效果和評價預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。和評價預(yù)后具有重要的

21、指導(dǎo)意義。酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺SDS-PAGE，含，含0.1明膠電明膠電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和和MMP-9恢復(fù)恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和和MMP-9活性成正比?；钚猿烧取?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作樣品制備

22、樣品制備: 血清、血漿和尿樣品可取適量直接與血清、血漿和尿樣品可取適量直接與2SDS 樣品緩沖液等體積混勻進(jìn)行下樣品緩沖液等體積混勻進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進(jìn)行稀釋一步實(shí)驗(yàn)，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進(jìn)行稀釋;凝膠的制備凝膠的制備: 玻璃板對齊后放入夾中垂直卡緊。按表格配玻璃板對齊后放入夾中垂直卡緊。按表格配10分離膠，加入分離膠，加入TEMED后后立即搖勻即可灌膠，灌膠時，可用立即搖勻即可灌膠，灌膠時，可用5ml加樣槍吸取凝膠沿玻璃板加進(jìn)去，然后膠上加一加樣槍吸取凝膠沿玻璃板加進(jìn)去，然后膠上加一層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進(jìn)凝膠聚合灌膠時開始可快一些，膠面

23、快到所需層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進(jìn)凝膠聚合灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時凝膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡）。約高度時要放慢速度。操作時凝膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡）。約幾分鐘后當(dāng)異丙醇和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了，再等幾分鐘后當(dāng)異丙醇和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了，再等3min使膠充分凝固使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面表格配就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面表格配4的濃縮膠，加入的濃縮膠，加入TEMED后后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要立即搖勻即

24、可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出;在每個加樣孔中加入在每個加樣孔中加入10 l樣品樣品;電泳：電泳： 在在4 100V下，約下，約2h;凝膠的處理：凝膠的處理： （1電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫?fù)u動下洗滌電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫?fù)u動下洗滌1h，其，其間換液一次；間換液一次； （2棄去洗滌緩沖液，然后加入孵育緩沖液沒過膠面，至棄去洗滌緩沖液，然后加入孵育緩沖液沒過膠面，至37恒溫箱中，恒溫箱中，24h后取后取出；出； （3棄去孵育緩沖液，加入棄去孵育緩沖液，加入0.1%考馬斯亮藍(lán)染液染色約考馬斯亮藍(lán)染液染色約30min，回收染液，加入脫，回收染液，加入脫色液脫色至藍(lán)色背景和白色條帶均十分明顯時，用色液脫色至藍(lán)色背景和白色條帶均十分明顯時，用5乙酸中止脫色；乙酸中止脫色； （4待凝膠在待凝膠在5乙酸中恢復(fù)到適當(dāng)大小后，用凝