山東大學(xué)微生物生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、 山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2015年 12 月 7日姓名 黃新迪 系年級(jí) 2014級(jí)生科3班 組別 5 同組者 高巖、國文潔、梁蕭科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 微生物的生理生化反應(yīng) 微生物的生理生化反應(yīng)一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 證明不同微生物對(duì)各種有機(jī)大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進(jìn)行微生物大分子物質(zhì)水解試驗(yàn)的原理和方法。3.了解糖發(fā)酵的原理和在腸細(xì)菌堅(jiān)定中的重要作用。4.掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。5. 了解吲哚和甲基紅試驗(yàn)的原理以及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。二、【實(shí)驗(yàn)儀器與試劑】菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌培養(yǎng)

2、基：培養(yǎng)基：固體淀粉培養(yǎng)基、固體油脂培養(yǎng)基（大分子水解試驗(yàn)）；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管）（糖發(fā)酵試驗(yàn)）；蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)）；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；試劑：盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水、儀器：酒精燈、接種針、培養(yǎng)皿、試管、試管架、燒杯、量筒、德漢氏小管三、【實(shí)驗(yàn)原理】1.在所有生活細(xì)胞中存在的全部生物化學(xué)反應(yīng)稱之為代謝，代謝過程主要是酶促反應(yīng)過程，由于各種微生物具有不同的酶系統(tǒng)，所以他們能利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應(yīng)來鑒別不同的細(xì)菌，尤其是在腸桿菌科細(xì)菌的鑒定中，生理生化試驗(yàn)占有重要

3、的地位。2.淀粉的水解：由于微生物對(duì)淀粉這種大分子物質(zhì)不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要為水解酶,通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物,使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi).如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精,雙糖和單糖；而淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，則能利用其周圍的淀粉，在淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)用碘處理其菌落周圍不呈藍(lán)色，而是無色透明圈，據(jù)此可分辨微生物能否產(chǎn)生淀粉酶。3.油脂的水解：在油脂培養(yǎng)基上接種細(xì)菌，培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察菌苔的顏色，若出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則說明此中菌可產(chǎn)生分解油脂的酶。4. 糖發(fā)酵試驗(yàn)：糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng),在腸道細(xì)

4、菌的鑒定上尤為重要.絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們?cè)诜纸馓穷愇镔|(zhì)的能力上有很大的差異.有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和氣體(如氫氣,甲烷,二氧化碳等);有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣.例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。產(chǎn)酸后再加入溴甲酚指示劑后會(huì)使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會(huì)收集到一部分氣體。若細(xì)菌不能使糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則最后溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無氣體。5.IMVC實(shí)驗(yàn)主要用于快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。（1）吲哚試驗(yàn)：是用來檢測(cè)吲哚的產(chǎn)生，在蛋白胨培養(yǎng)基中，若細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，則可將蛋白胨中的色氨酸分解為丙酮酸和吲哚，吲哚與對(duì)二甲基苯甲醛

5、反應(yīng)生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，所以吲哚實(shí)驗(yàn)可以作為一個(gè)生物化學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)。大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。（2）甲基紅試驗(yàn)（MR）：某些細(xì)菌在糖代謝過程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者進(jìn)而被分解產(chǎn)生甲酸，乙酸和乳酸等多種有機(jī)酸，培養(yǎng)基就會(huì)變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，即甲基紅反應(yīng)。大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。四、【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 淀粉水解實(shí)驗(yàn)（1）倒平板：按照淀粉培養(yǎng)基配方配制固體淀粉培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50左右，在酒精燈火焰旁倒平板，每組兩個(gè)平板。 （2）用記號(hào)筆在平板底部劃成四部分。 （3）接種：在無菌

6、操作臺(tái)上，將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在不同的部分點(diǎn)種，如圖一所示，注意僅用接種針接觸極少面積的培養(yǎng)基，在平板的反面對(duì)應(yīng)部分貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別寫上菌名，以免混淆。 （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28溫箱中培養(yǎng)兩天。 （5）觀察：取出培養(yǎng)基，觀察各種細(xì)菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板，觀察培養(yǎng)皿中菌落周圍是否有無色透明圈，若有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已經(jīng)被水解，為陽性，反之則為陰性。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 圖一：淀粉水解試驗(yàn)接種示意圖 圖二：油脂水解試驗(yàn)接種示意圖2.油脂水解試驗(yàn)（1）倒平板：按照油脂培養(yǎng)基配方配制固

7、體油脂培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50左右，充分振蕩，使油脂均勻分布，在酒精燈火焰下倒平板，每組兩個(gè)平板。 （2）用記號(hào)筆在在平板底部劃成四部分。 （3）接種：在無菌操作臺(tái)上將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別劃十字線接種于平板相對(duì)應(yīng)部分的中心，如圖二所示，并貼好標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明菌種的名稱。 （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28溫箱中培養(yǎng)兩天。（5）觀察：取出平板，觀察菌苔顏色，如果出現(xiàn)紅斑點(diǎn)，說明脂肪水解，為陽性反應(yīng)。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn) （1）培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏小管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置

8、放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進(jìn)入空氣，每組五只試管，滅菌。（2）接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時(shí)，在無菌操作臺(tái)上，取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支接入大腸桿菌，再取兩只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡，第五支不接種，作為對(duì)照。在各試管外壁上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細(xì)菌菌名。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。（4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 4.乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（1）培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏小管中注

9、滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進(jìn)入空氣，每組五只試管，滅菌。（2）接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時(shí)，在無菌操作臺(tái)上，取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支接入大腸桿菌，再取兩只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡第五支不接種，作為對(duì)照。在各試管外壁上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細(xì)菌菌名。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。（4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5.吲哚試驗(yàn) （1）培養(yǎng)基的配制：按照蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組五只

10、試管，在高壓蒸氣鍋內(nèi)滅菌。（2）接種：待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌操作臺(tái)上將大腸桿菌接入2支蛋白胨水培養(yǎng)基，產(chǎn)氣腸桿菌接入2支蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對(duì)照，貼好標(biāo)簽。（3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。（4）觀察：往培養(yǎng)后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加入34滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管避徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性反應(yīng)。觀察加入試劑后試管內(nèi)的顏色反應(yīng)并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 6.甲基紅試驗(yàn) （1）培養(yǎng)基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組五只試管，在高壓蒸氣鍋內(nèi)滅

11、菌。（2）接種：待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌操作臺(tái)上將大腸桿菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，產(chǎn)氣腸桿菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對(duì)照，貼好標(biāo)簽。（3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。（4）觀察：培養(yǎng)兩天后后，將每支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)物內(nèi)加入2滴甲基紅試劑，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性，變?yōu)辄S色者為陰性。觀察試管內(nèi)的顏色變化，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。五、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析】實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄淀粉水解試驗(yàn):表1.淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰 / 陽性結(jié)論大腸桿菌+可以水解淀粉枯草芽孢桿菌+可以水解淀粉變形桿菌-不可

12、以水解淀粉銅綠假單胞菌+可以水解淀粉油脂水解試驗(yàn):表2. 油脂水解試驗(yàn)結(jié)果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰 / 陽性結(jié)論大腸桿菌+可以水解油脂枯草芽孢桿菌+可以水解油脂變形桿菌-不以水解油脂銅綠假單胞菌+可以水解油脂葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：表3. 葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白試管1試管2試管3試管4試管5顏色變化黃色黃色紫色是否產(chǎn)氣是是否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌可以分解葡萄糖，同時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣。普通變形桿菌能分解葡萄糖，同時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣。對(duì)照組乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基:表4. 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白試管1試管

13、2試管3試管4試管5顏色變化黃色紫色紫色是否產(chǎn)氣是否否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌能分解乳糖，故產(chǎn)酸產(chǎn)氣。普通變形桿菌不能分解乳糖，故不產(chǎn)酸不氣。對(duì)照組吲哚試驗(yàn):表5.吲哚試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌試管1試管2試管3試管4是否產(chǎn)生紅色環(huán)狀物否否陰/陽性-結(jié)論大腸桿菌不可以分解色氨酸為吲哚產(chǎn)氣腸桿菌不能分解色氨酸為吲哚甲基紅試驗(yàn):表6. 甲基紅試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌試管1試管2試管3試管4顏色變化變紅變紅陰/陽性+結(jié)論大腸桿菌在培養(yǎng)期仍維持酸性pH產(chǎn)氣腸桿菌在培養(yǎng)期仍維持酸性pH淀粉分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果 油脂分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果 葡萄糖發(fā)酵

14、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果 甲基紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果 吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、【注意事項(xiàng)】1.淀粉水解試驗(yàn)中，觀察各種細(xì)菌生長情況時(shí)，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。2.油脂水解試驗(yàn)中，制備固體油脂培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)充分搖蕩，使油脂均勻分布。3.接種前要用記號(hào)筆做好標(biāo)記，接種時(shí)要對(duì)號(hào)接種，以免接錯(cuò)菌種，造成混亂。4.糖發(fā)酵試驗(yàn)中，接種后要輕緩搖動(dòng)試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。否則會(huì)造成假象，得出錯(cuò)誤的結(jié)果。5.吲哚試驗(yàn)中，注意加入34滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，再沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。否則就會(huì)觀察不到在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生的紅色環(huán)狀物。6.甲基紅

15、試驗(yàn)中，應(yīng)該注意甲基紅試劑不要加得太多，以免出現(xiàn)假陽性。7.在使用酒精燈時(shí)要特別注意，避免酒精燈爆炸。8. 接種均在無菌條件下操作，接種完畢以后用滅菌好的棉花塞住管口防止污染。七、【思考題】1. 你怎么樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？答：淀粉是大分子物質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞十分困難，甚至需要觸及高耗能的胞吞作用。因而通過胞外酶的作用，將淀粉水解為葡萄糖后運(yùn)入細(xì)胞，較方便高效。試驗(yàn)中菌苔周圍出現(xiàn)透明圈，說明培養(yǎng)基內(nèi)淀粉被水解，可推測(cè)是細(xì)菌細(xì)菌將淀粉酶分泌到胞外所致，因此為胞外酶。2. 不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？答：淀粉水解為葡萄糖才能被細(xì)胞利用，因此可以換用斐林試劑。呈陽性者則說明產(chǎn)生了葡萄糖

16、，淀粉被水解；陰性者說明淀粉未被水解。3. 假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗(yàn)應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？答：由于產(chǎn)生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，因此顏色不變化，仍為紫色。德漢氏小管中有氣柱。4. 討論IMViC試驗(yàn)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上的意義。答：可以鑒別某些疾病是由大腸桿菌還是產(chǎn)氣腸桿菌引起的。5. 解釋在細(xì)菌培養(yǎng)中吲哚檢測(cè)的化學(xué)原理，為什么在這個(gè)試驗(yàn)中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？答：有些細(xì)菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對(duì)二甲基氨基甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚試驗(yàn)可以作為一個(gè)生物化

17、學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)。 因?yàn)楸崾巧矬w呼吸作用的產(chǎn)物，無論是有氧還是無氧，都會(huì)產(chǎn)生丙酮酸，因而無法作為色氨酸酶活性的指示劑進(jìn)行區(qū)分。 同時(shí)吲哚能通過有明顯顏色變化的化學(xué)反應(yīng)觀測(cè)到，而丙酮酸不能，所以試驗(yàn)中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸。 6.為什么大腸桿菌是甲基紅反應(yīng)陽性？當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色（PH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（PH4.2），即甲基紅反應(yīng)。而大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機(jī)酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)的后期仍能維持酸性PH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大約6。因此，大腸桿菌

18、為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。八、【實(shí)驗(yàn)總結(jié)】各種細(xì)菌在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同的細(xì)菌分解大分子碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的能力不同，所能發(fā)酵的類型和最終產(chǎn)物也不一樣。不同細(xì)菌對(duì)營養(yǎng)的要求不同也說明了它們有不同的合成能力。所有這些都反映了它們是有不同的酶系統(tǒng)。細(xì)菌的這種生化反應(yīng)的多樣性在自然界產(chǎn)生了兩種結(jié)果：第一、使自然界所有的有機(jī)分子都有可能得到分解；第二、使不同細(xì)菌之間有了互相作用和互相依賴的基礎(chǔ)，例如，一種微生物能利用另一種微生物所分解的產(chǎn)物。另一方面，細(xì)菌的生化反應(yīng)的多樣性也被人們作為細(xì)菌的鑒定和分類方法來利用。本實(shí)驗(yàn)是通過細(xì)菌對(duì)大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、鑒定腸道菌的其他不同生化反應(yīng)等幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，來證明不同的細(xì)菌其