實(shí)驗?zāi)康恼莆誔CR原理熟悉PCR的基本操作

1、實(shí)驗?zāi)康?. 掌握PCR原理；2. 熟悉PCR的基本操作。實(shí)驗五 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR（一）PCR簡介1. 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）誕生于1985年，是根據(jù)生物體內(nèi)DNA復(fù)制的某些特點(diǎn)而設(shè)計的在體外對特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增的一項技術(shù)。美國Cetus 公司的Kary Mullis發(fā)明了該技術(shù)（1993年諾貝爾化學(xué)獎）。2. 操作過程的簡化依賴于以下兩項技術(shù)： 1）熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶的應(yīng)用； 2）自動化熱循環(huán)儀的設(shè)計成功。3.該項技術(shù)對分子生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等產(chǎn)生了革命性的影響。體內(nèi)DNA復(fù)制過程的體外模擬（

2、二）基本原理1PCR的特征：能大量擴(kuò)增特定序列，引物結(jié)合位置將決定擴(kuò)增的DNA序列。 2PCR包括3個熱循環(huán)過程： 1）雙鏈DNA的高溫變性（解鏈）； 2）引物與模板的低溫退火（引物與模板結(jié)合）； 3）適宜溫度下的引物延伸（互補(bǔ)鏈的合成）。 PCR擴(kuò)增時，靶DNA序列產(chǎn)量隨著循環(huán)次數(shù)呈指數(shù)增加，從而達(dá)到迅速大量擴(kuò)增的目的。3. 擴(kuò)增過程熱預(yù)變性高溫變性適溫延伸低溫退火補(bǔ)償延伸4. PCR原理：第一循環(huán)原理：第一循環(huán)引物引物模板模板DNA雙鏈雙鏈模板模板DNA單鏈單鏈前兩個循環(huán)前兩個循環(huán)前三個循前三個循環(huán)環(huán)目標(biāo)分子目標(biāo)分子計算表明：用計算表明：用基因特異性引基因特異性引物擴(kuò)增目的基物擴(kuò)增目的基因

3、時，若假設(shè)因時，若假設(shè)開始模板分子開始模板分子數(shù)為數(shù)為x，經(jīng)過，經(jīng)過n個循環(huán)后，目個循環(huán)后，目的分子個數(shù)為的分子個數(shù)為x(2n-2n)(三)反應(yīng)體系 模板DNA； 引物對； 4種脫氧核苷三磷酸； 耐熱DNA聚合酶； 適宜的緩沖液。 1模板DNA(template)：單鏈DNA或雙鏈DNA，cDNA 注意事項： 1）用DNA粗制品做樣品，應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)等； 2）要被擴(kuò)增的DNA特定序列不需要事先從樣品中分離純化，因為PCR產(chǎn)物的序列，即反應(yīng)的特異性，是由寡核苷酸引物序列所決定的。 3）PCR所需的DNA模板量較低。2引物：primer 1)

4、概念：是指兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列側(cè)翼片段互補(bǔ)的寡核苷酸。引物序列決定了PCR擴(kuò)增片段的長度、位置和結(jié)果。 2）引物設(shè)計上的基本原則： a: 一般為2030 bp； b: G+C含量：應(yīng)在45%55%之間； c: 堿基分布的隨機(jī)性； d: 引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列； e: 引物之間：兩個引物之間不形成引物二聚體； f: 特異性：與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于10%，或少于連續(xù)8個互補(bǔ)堿基； g: 引物的3端：3端不應(yīng)發(fā)生錯配；34種dNTPs：靶DNA序列的擴(kuò)增原料。 注意事項： 1） dNTPs貯存液pH值應(yīng)為7.0； 2）每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50200mol/L為宜。 3）4種

5、dNTPs的濃度應(yīng)相同。4DNA聚合酶 1）Klenow片段：又叫Klenow聚合酶或pol I大片段酶。它能識別和消除錯配的引物末端，以校正復(fù)制過程中錯配的核苷酸。缺點(diǎn)：反應(yīng)溫度為37 2）Taq DNA 聚合酶：最初是從美國黃石國家公園的一個溫泉中發(fā)現(xiàn)的一種嗜熱菌水生棲熱菌（Thermus aquatics）YT菌株中分離而得。此酶的最適作用溫度為72。（四）循環(huán)參數(shù) 1變性溫度和時間原則上變性步驟應(yīng)高溫，短時，既要保證變性充分，又要保持聚合酶在整個反應(yīng)中的活性。2退火溫度：退火溫度和時間取決于引物的長度、堿基組成及其在反應(yīng)體系中的濃度。通常反應(yīng)條件為55。3引物延伸 1）引物延伸溫度：T

6、aq DNA聚合酶通常為72。 2）延伸步驟的時間：1000 bp/min。4循環(huán)次數(shù)： 一般為25-40個周期。（五）PCR擴(kuò)增儀 1機(jī)械自動裝置：固定溫度控制部分，依據(jù)每一個保溫階段對溫度的要求，將樣品在三個控溫部分之間模擬手工操作進(jìn)行機(jī)械移動。 左到右有三個恒溫水浴鍋?zhàn)蟮接矣腥齻€恒溫水浴鍋95度度 52度度 72度度2溫度循環(huán)裝置：整個PCR過程中，樣品在樣品臺上保持相同的物理狀態(tài)，而用一軟件控制的加熱/冷卻系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)周期性溫度改變及恒溫過程的自動化。（六）實(shí)驗操作1. 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建 （總體積：20.0 l ） 反應(yīng)體系反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)加入量（標(biāo)準(zhǔn)加入量（l） 實(shí)際加入量（實(shí)際加入量（l）10buffer2.064dNTPs（10M each）0.44模板1.01正向引物0.83反向引物0.83Taq 聚合酶0.33ddH2O14.702PCR擴(kuò)增反應(yīng) 按下列程序，在DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)。 94 3 min (預(yù)變性)；94 40 s, 52 40 s,72 40s, 35個循環(huán)，72 10 min(再延伸)；4保存。3結(jié)果檢測 擴(kuò)增樣品在0.8 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。（七）思考題1PCR技術(shù)的基本實(shí)驗原理？ 2. 引物設(shè)計上應(yīng)考慮哪些方面？實(shí)驗教師準(zhǔn)備稀釋的試劑原始試劑名